寧科賢，黃燕萍

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西南寧530021；2.廣西壯族自治區(qū)北海食品藥品檢驗(yàn)所，廣西北海536000）

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定炎熱清片中梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素含量

寧科賢1，黃燕萍2

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西南寧530021；2.廣西壯族自治區(qū)北海食品藥品檢驗(yàn)所，廣西北海536000）

目的建立同時(shí)測(cè)定炎熱清片中梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法采用Eclipse XDB柱（150mm× 4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫，流速為0.80mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)0～10min為238 nm、10.01～45min為275 nm。結(jié)果梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素的質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.30～86.10μg/mL（r=0.999 8），4.36～175.00μg/mL（r=1.000 0），1.15～46.10μg/mL（r=0.999 9）。方法回收率均不低于98%。結(jié)論該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，能排除其他成分的干擾，可用于炎熱清片的質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)。

高效液相色譜法；梔子苷；黃芩苷；漢黃芩素；炎熱清片

炎熱清片由玄參、龍膽、石膏、柴胡、梔子、黃芩、薄荷腦等7味中藥組方，具有解表清里、清熱解毒功效；臨床用于呼吸道炎，如支氣管炎、肺炎、急性扁桃體炎，也可用于泌尿系感染、膽道感染［1］。原標(biāo)準(zhǔn)只有黃芩苷的含量測(cè)定項(xiàng)，文獻(xiàn)［2］報(bào)道了測(cè)定炎熱清片中龍膽苦苷的含量，但同時(shí)測(cè)定炎熱清片梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素3種成分尚未見報(bào)道。參考文獻(xiàn)［3-10］建立了同時(shí)測(cè)定炎熱清片中梔子、黃芩的主要成分梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素含量的高效液相色譜（HPLC）法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

Agilent1200型高效液相色譜儀，Agilent1200 LC型色譜工作站，G1322A型溶劑脫氣機(jī)（DEGASSER），G1311A型四元泵（Quat Pump），G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器（ALS），G1314B VWD型紫外檢測(cè)器；CP225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯）；COBOSAW-120型自動(dòng)電子天平；SB3200WS型超聲波清洗器（上海必能信）；Type HT-203A column HEATER（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110749-200714，110715-200815，110821-200711）；炎熱清片（樣品1，吉林國(guó)藥制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)為20130301；樣品2，吉林天藥本草堂制藥有限公司，批號(hào)為120801；樣品3，武漢鈞安制藥有限公司，批號(hào)為130201）；水為超純水，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液制備

精密稱取梔子苷、黃芩苷、漢黃芩素對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑，配制成混合對(duì)照品溶液，其中含梔子苷0.430 5 g/L、黃芩苷0.436 4 g/L、漢黃芩素0.115 3 g/L。取本品10片，除去包衣后，精密稱定，研細(xì)，取約0.5片的量，精密稱定，精密加入70%乙醇20mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250W，頻率40 kHz）40min，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例，分別配制缺梔子和缺黃芩的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2色譜條件系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Eclipse XDB柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫流動(dòng)相比例見表1；流速：0.80mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～10min為238 nm，10.01～45min為275 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)應(yīng)不低于1 500［2］。分別取2.1項(xiàng)下3種溶液注入色譜儀，色譜圖見圖1。在此色譜條件下，梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素與相鄰組分峰的分離度均大于1.5，陰性樣品在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上無吸收峰，表明處方中的其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。

2.3方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，倍比稀釋法配置成系列質(zhì)量濃度的溶液。進(jìn)樣10μL，測(cè)定各組分峰面積，以各組分質(zhì)量濃度（C）橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，梔子苷為A=17.974C+13.081（r=0.999 8），黃芩苷為A=16.210C+4.696 7（r=1.000 0），漢黃芩素為A= 23.840C+2.288 7（r=0.999 9），梔子苷、黃芩苷和漢黃芩苷質(zhì)量濃度分別在4.30～86.10μg/mL，4.36～175.00μg/mL和1.15～46.10μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表1　梯度洗脫流動(dòng)相比例

圖1　高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果梔子苷、黃芩苷、漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.03%，0.29%，0.95%（n=6）。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品約0.5片的量,共6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL。結(jié)果梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素含量的RSD分別為1.26%，0.78%，1.19%（n=6）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別在0，1，2，4，6，8，10，12 h時(shí)進(jìn)樣10μL，記錄色譜峰面積。結(jié)果梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素峰面積的RSD分別為1.22%，0.87%，1.08%（n=8）。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已測(cè)定梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素含量的樣品（批號(hào)為20130301）9份（每份約0.25片的量），精密稱定，分別精密加入一定量的梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備溶液并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)的樣品，按供試品溶液制備方法處理并測(cè)定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算梔子苷、黃芩苷和漢黃芩素的含量（以每片含量計(jì)），結(jié)果見表3。

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3　討論

嘗試用單一流動(dòng)相洗脫，比較了乙腈-水（15∶85）、甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）［2］，結(jié)果分離效果差或只能測(cè)單一成分；用甲醇-0.2%磷酸溶液［5］、乙腈（A）-1%的磷酸溶液［6］等不同組成的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，效果都不理想。故選擇乙腈-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相，各成分分離較好，峰形較佳。

經(jīng)紫外吸收測(cè)定，梔子苷于238 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，黃芩苷于276，315 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，漢黃芩素于275 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。當(dāng)選擇單一波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，則必有其中的1個(gè)成分響應(yīng)值很小，而由于漢黃芩素含量較黃芩苷低很多，為提高漢黃芩素的檢測(cè)靈敏度，故選用275 nm為切換測(cè)定波長(zhǎng)。通過比較，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)在0～10min為238 nm、10.01～45min為275 nm同時(shí)測(cè)定3個(gè)成分的效果較佳。

分別用甲醇、乙醇、50%甲醇、70%乙醇作為提取溶劑，超聲提取40min或70%乙醇超聲提取20，30，40，50min等進(jìn)行提取考察。結(jié)果以甲醇為溶劑的提取方法最簡(jiǎn)便、提取完全。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同廠家、不同批號(hào)的炎熱清片中梔子苷和漢黃芩素的含量有差別，特別是漢黃芩素的含量，提示不同生產(chǎn)工藝制備出的炎熱清片內(nèi)在質(zhì)量有差異。炎熱清片現(xiàn)有的質(zhì)量控制方法較簡(jiǎn)單，不能有效地控制質(zhì)量，本試驗(yàn)中所建立的方法簡(jiǎn)單、可靠，可作為評(píng)價(jià)炎熱清片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一。

［1］YBZ06252008.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［2］趙昱瑋，于淼，司學(xué)玲，等.炎熱清片中龍膽苦苷的薄層鑒別及含量測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（3）：118-120.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：231，282.

［4］戢艷瓊，李洪亮，張秋芳.HPLC法測(cè)定復(fù)方魚腥草合劑中綠原酸、黃芩苷的含量的含量［J］.中國(guó)藥師，2012，15（6）：828-830.

［5］費(fèi)毅琴，聶晶.HPLC法同時(shí)測(cè)定清熱解毒軟膠囊中黃芩苷和梔子苷的含量［J］.中國(guó)藥事，2012，26（5）：490-493.

［6］周蓬，宋青，馬帥.HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒豉翹清熱顆粒中梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素［J］.中成藥，2013，35（8）：1 693-1 696.

［7］劉阿靜，齊廣才，劉珍葉，等.RP-HPLC法測(cè)定防風(fēng)通圣丸中芍藥苷、梔子苷、黃芩苷和連翹苷的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27（5）：415-417，437.

［8］趙霞，楊麗.HPLC法測(cè)定雙黃連顆粒中梔子苷的含量［J］.中國(guó)藥事，2012，26（1）：59-60，63.

［9］周燕，俞秀.HPLC法測(cè)定雙黃連膠囊中梔子苷、黃芩苷、連翹苷的含量［J］.中國(guó)藥師，2012，15（1）：72-74.

［10］喬靜，李洪亮.HPLC法同時(shí)測(cè)定大衛(wèi)顆粒中梔子苷、連翹苷、黃芩苷的含量［J］.中國(guó)藥師，2011，14（7）：985-986.

Determ ination of Geniposide，Baicalin and W ogonin in Yanreqing Tabelts by HPLC

Ning Kexian1，Huang Yanping2
（1.Depa rtment of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，NanNing，Guangxi，China 530021；
2.The Food and Drud Inspection of BeiHai，Guangxi，China 536000）

Objective An HPLC method was established for the determination of geniposide,baicalin and wogonin in Yanreqing Tablets. M ethods Eclipse XDB column（150 mm×4.6 mm,5μm）was used with the mobile phase of acetonitrile-0.4%phosphoric acid solution by gradient elutio,the flow rate was 0.80 mL/min.The detection wavelength was 0-10 min,238 nm,10.01-45 min,275 nm. Results The HPLC method showed agood linear relationship in the range of 4.30-86.10μg/mL（r=0.999 8）for geniposide,4.36-175.00μg/mL（r=1.000 0）for baicalin,1.15-46.10μg/mL（r=0.999 9）for wogonin.Recoveries for the three components were all above 98%.Conclusion The method is simple，accurate with good reproducibility，and can be used for the quality control of the Yanreqing Tabelts.

HPLC；geniposide；baicalin；wogonin；Yanreqing tablets

R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0089-03?

寧科賢，主管藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作，（電話）0771-5305902（電子信箱）1094452708@qq.com；黃燕萍，主任藥師，研究方向?yàn)槭称放c藥品檢驗(yàn)，本文通訊作者，（電話）0779-6803508（電子信箱）huangyanping500@163.com。

2014-11-28）