劉小麗+朱夢(mèng)晴+許楠等

摘 要：以白術(shù)（Atractylodes macrocephala）種子為實(shí)驗(yàn)材料，研究了不同消毒條件對(duì)白術(shù)種子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：隨著NaClO濃度的增加，殺菌效果越來越好，但發(fā)芽率卻越來越低。就本實(shí)驗(yàn)而言，先把白術(shù)種子在流水下沖2h，剝?nèi)シN皮，再在流水下沖1h，之后用75%的酒精浸泡30s，最后用10%的NaClO溶液浸泡15min，效果最好。對(duì)于白術(shù)幼苗生長(zhǎng)的影響，還有待于進(jìn)一步的研究和總結(jié)。

關(guān)鍵詞：白術(shù)；種子萌發(fā)；NaClO溶液

中圖分類號(hào) Q947.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）19-22-04

Influence of Different Sterilization Conditions on Atractylodes macrocephala Seed Germination

Liu Xiaoli1，2 et al.

（1School of Life Sciences，F(xiàn)uyang Normal University，F(xiàn)uyang 236041，China；2Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine，F(xiàn)uyang 236041，China）

Abstract：Taking Atractylodes macrocephala seeds as experimental materials，the thesis studied the effects of different sterilization conditions on germination of Atractylodes macrocephala seeds. The experimental results show that：with the increasing of NaClO concentration，bactericidal effect is better，but the germination rate is lower. Therefore，in this experiment，firstly rinse the Atractylodes macrocephala seeds under running water for 2 hours，stripped off the seed coat，and then rinse them under running water for another 1 hour，then soak for 30 seconds with 75% alcohol，immersed in 10% NaClO solution for 15 mins，In this case，the effect is the best.The influence on Atractylodes macrocephala seedlings growth still needs further study and conclusion.

Key words：Atractylodes macrocephala；Seed germination；NaClO solution

白術(shù)（Atractylodes macrocephala）是菊科蒼術(shù)屬藥用植物，具有燥濕利水、健脾益氣、止汗安胎之效[1]，同時(shí)還具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎抗菌等藥用作用[2]，有效成分主要是白術(shù)多糖、白術(shù)內(nèi)酯、揮發(fā)性成分以及白術(shù)氨基酸[2]。由于其具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前對(duì)于白術(shù)的高產(chǎn)栽培技術(shù)[3]及莖尖組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)優(yōu)化[4]已有研究。

1 材料與方法

1.1 材料 白術(shù)種子，2012年采于亳州。經(jīng)適度的晾曬，選取飽滿的種子作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 自來水，蒸餾水，無菌水，NaClO溶液（濃度分別為1%、6%、8%、10%、12%、14%），75%的酒精。

1.2.2 MS培養(yǎng)基的配制 （1）配制好MS培養(yǎng)基的4種母液：母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ，母液Ⅳ。（2）配制400mLMS培養(yǎng)基需要：母液Ⅰ20mL，母液Ⅱ、母液Ⅲ、母液Ⅳ各2mL，瓊脂3.2g，蔗糖12g，然后加蒸餾水定容至400mL，調(diào)節(jié)pH為6.0。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 生化培養(yǎng)箱（ZSD-A1270）、恒溫振蕩器（ZHWY-100B）、電子精密天平（FAI604N）、數(shù)碼恒溫水浴鍋（HH-2）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（XMTD-8222）、海爾低溫保存箱（DW-401262）、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、移液槍以及其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)用具。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 高壓滅菌處理 將待用的燒杯，培養(yǎng)瓶，配置好的MS培養(yǎng)基以及其他待用的可以滅菌的東西用報(bào)紙包好，放入高壓滅菌鍋中滅菌。

1.4.2 種子前期處理 （1）挑選飽滿且大小相同的白術(shù)種子100粒，分為2組，每組50粒。一組用自來水緩緩沖2h，剝?nèi)シN皮，再在緩流下沖1h；另一組只用自來水沖洗3h，不剝?nèi)シN皮。然后2組種子都用75%的酒精浸泡30s，用無菌水沖洗4次，將其播種于培養(yǎng)基上，每組5瓶，每瓶10粒，放于相同條件下培養(yǎng)，觀察萌發(fā)情況和被污染的情況。（2）挑選50粒同樣飽滿且大小相同的白術(shù)種子，用自來水緩緩沖2h，剝?nèi)シN皮，再在緩流下沖1h后，用75%的酒精浸泡30s，用無菌水沖洗4次，再用20mL的1%的NaClO溶液浸泡，然后將在NaClO溶液中浸泡的種子放在轉(zhuǎn)速為180r/min、溫度為28℃的搖床上振蕩8h，換無菌水后仍放在相同轉(zhuǎn)速和溫度的搖床上振蕩過夜后從搖床中取出，在超凈工作臺(tái)中用無菌水沖洗至無色后，接種于培養(yǎng)基上，每組5瓶，每瓶10粒。放于和上述相同的條件下培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。

1.4.3 種子消毒處理 通過對(duì)種子前期處理的比較，選出最好的處理方法，接著進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：（1）設(shè)置相同的浸泡時(shí)間5min，將前期處理后的種子，分別放入以下5種濃度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡；（2）設(shè)置相同的浸泡時(shí)間10min，將前期處理后的種子，分別放入以下5種濃度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡；（3）設(shè)置相同的浸泡時(shí)間15min，將前期處理后的種子，分別放入以下5種濃度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡；（4）設(shè)置相同的浸泡時(shí)間20min，將前期處理后的種子，分別放入以下5種濃度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡；（5）設(shè)置相同的浸泡時(shí)間25min，將前期處理后的種子，分別放入以下5種濃度：6%、8%、10%、12%、14%的NaClO溶液中浸泡。然后將這些浸泡后的種子用無菌水沖洗，并且在沖洗的過程中要來回振蕩燒杯，使燒杯中的種子與無菌水充分接觸，直到燒杯中的無菌水呈現(xiàn)無色，停止沖洗。用吸水紙吸干種子表面的水分。將其播種在裝有大約30mL的固體MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶中放10粒種子，相同處理時(shí)間的每個(gè)濃度4瓶。把培養(yǎng)瓶放在20℃恒溫條件下培養(yǎng)，觀察種子的萌發(fā)情況和污染情況。

1.4.4 種子轉(zhuǎn)移 通過以上的處理，在培養(yǎng)瓶中的種子有的會(huì)萌發(fā)，有的會(huì)被污染，也可能會(huì)萌發(fā)的同時(shí)也被污染，于是我們挑選出那些未被污染的種子，將其放在新的盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在相同的條件下培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。若是仍有污染，則繼續(xù)轉(zhuǎn)移，直至沒有污染，為培養(yǎng)出無菌苗奠定基礎(chǔ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子的前期處理 從表1可以看出，3組種子中都有未萌發(fā)的，原因可能是種子自身的因素，也可能是實(shí)驗(yàn)過程中試劑或是操作對(duì)其的影響。是否剝?nèi)シN皮對(duì)種子的萌發(fā)影響很小，但污染的情況卻不同：剝?nèi)シN皮后，污染率較低，而未剝?nèi)シN皮的污染率較高，原因可能是種皮上帶有大量的霉菌、細(xì)菌等微生物；而NaClO溶液浸泡的的種子雖然污染率降低了，但萌發(fā)率卻不高，可能是由于在NaClO溶液中浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，影響了種子的活力，從而影響種子的萌發(fā)率。通過以上3組實(shí)驗(yàn)的比較，選取用自來水緩緩沖2h，剝?nèi)シN皮，再在緩流下沖1h的方法對(duì)種子進(jìn)行前期處理，效果最好。

表1 種子剝皮與否和NaClO溶液處理后的觀察結(jié)果

[組別＼&接種數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)數(shù)

（粒）＼&污染數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)率

（%）＼&污染率

（%）＼&剝皮＼&50＼&44＼&42＼&88＼&84＼&未剝皮＼&50＼&41＼&48＼&82＼&96＼&NaClO溶液的處理＼&50＼&31＼&39＼&62＼&78＼&]

2.2 種子的消毒處理 從表2～表6可以看出，隨著NaClO溶液濃度的增加，相同時(shí)間浸泡的種子的發(fā)芽率逐漸降低，而殺菌效果卻呈上升趨勢(shì)；而且隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，相同濃度的溶液浸泡后發(fā)芽的種子數(shù)目在下降，而殺菌效果越來越好。表2和表3中，雖然萌發(fā)率很高，但污染卻較為嚴(yán)重；表5和表6污染率較低，但萌發(fā)率也低；表4中的萌發(fā)率都在50%之上，而污染率除了濃度為6%的其他濃度浸泡后都在50%之下，較為理想。通過以上的比較，選取表4中，即選擇用不同濃度的NaClO溶液浸泡15min效果最佳。當(dāng)NaClO的濃度為8%、10%時(shí)，種子的萌發(fā)率和殺菌效果較為理想，效果較好。又通過轉(zhuǎn)移后種子和無菌苗的生長(zhǎng)狀況，選取10%的效果最好。

表2 不同濃度NaClO溶液處理種子5min的效果

[NaClO濃度（%）＼&接種數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)數(shù)

（粒）＼&污染數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)率（%）＼&污染率（%）＼&6＼&40＼&34＼&32＼&85＼&80＼&8＼&40＼&32＼&31＼&80＼&77.5＼&10＼&40＼&30＼&29＼&75＼&72.5＼&12＼&40＼&27＼&28＼&67.5＼&70＼&14＼&40＼&24＼&25＼&60＼&62.5＼&]

表3 不同濃度NaClO溶液處理種子10min的效果

[NaClO濃度（%）＼&接種數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)數(shù)

（粒）＼&污染數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)率

（%）＼&污染率

（%）＼&6＼&40＼&33＼&32＼&82.5＼&80＼&8＼&40＼&31＼&30＼&77.5＼&75＼&10＼&40＼&29＼&28＼&72.5＼&70＼&12＼&40＼&25＼&25＼&62.5＼&62.5＼&14＼&40＼&22＼&23＼&55＼&57.5＼&]

表4 不同濃度NaClO溶液處理種子15min的效果

[NaClO濃度（%）＼&接種數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)數(shù)

（粒）＼&污染數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)率

（%）＼&污染率

（%）＼&6＼&40＼&31＼&23＼&77.5＼&57.5＼&8＼&40＼&30＼&20＼&75＼&50＼&10＼&40＼&28＼&18＼&70＼&45＼&12＼&40＼&25＼&17＼&62.5＼&42.5＼&14＼&40＼&21＼&15＼&52.5＼&37.5＼&]

表5 不同濃度NaClO溶液處理種子20min的效果

[NaClO濃度（%）＼&接種數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)數(shù)

（粒）＼&污染數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)率

（%）＼&污染率

（%）＼&6＼&40＼&23＼&18＼&57.5＼&45＼&8＼&40＼&20＼&16＼&50＼&40＼&10＼&40＼&18＼&15＼&45＼&37.5＼&12＼&40＼&17＼&13＼&42.5＼&32.5＼&14＼&40＼&15＼&11＼&37.5＼&27.5＼&]

表6 不同濃度NaClO溶液處理種子25min的效果

[NaClO濃度（%）＼&接種數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)數(shù)

（粒）＼&污染數(shù)

（粒）＼&萌發(fā)率

（%）＼&污染率

（%）＼&6＼&40＼&19＼&16＼&47.5＼&40＼&8＼&40＼&17＼&14＼&42.5＼&35＼&10＼&40＼&14＼&13＼&35＼&32.5＼&12＼&40＼&13＼&11＼&32.5＼&27.5＼&14＼&40＼&10＼&8＼&25＼&20＼&]

3 結(jié)論

對(duì)白術(shù)種子萌發(fā)的研究是本實(shí)驗(yàn)的目的，為了提高播種質(zhì)量，預(yù)先要進(jìn)行浸種催芽處理[5]。浸種時(shí)間的長(zhǎng)短，對(duì)種子的吸水情況有顯著影響，而合適的浸種時(shí)間有利于提高種子的發(fā)芽率。而對(duì)種子浸種產(chǎn)生的效果，專家學(xué)者們卻持不同的看法，一種看法是種子催芽前不適宜浸種，因?yàn)榻N后種子的發(fā)芽率會(huì)降低[6]，另一種看法是浸種時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)種子的發(fā)芽率并沒有顯著的影響[7-8]。也有人認(rèn)為，浸種時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)影響種子發(fā)芽率的提高。而本實(shí)驗(yàn)直接采用流水對(duì)種子進(jìn)行沖，而后又通過不同處理?xiàng)l件對(duì)白術(shù)種子進(jìn)行消毒，從而找到最優(yōu)化的處理?xiàng)l件，獲得無菌苗，為進(jìn)一步利用無菌苗的根、莖、葉誘導(dǎo)毛狀根奠定基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)表明，用自來水緩緩沖2h，剝?nèi)シN皮，再在緩流下沖1h，然后用75%的酒精浸泡30s，用無菌水沖洗4次；再在濃度為10%的NaClO溶液中浸泡15min，最后將這些浸泡后的種子用無菌水沖洗至無色；用吸水紙吸干種子表面的水分。將其播種在裝有大約30mL的固體MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，效果最佳。圖1為經(jīng)過以上步驟后萌發(fā)的種子。

圖1 種子萌發(fā)情況

4 討論

水是種子萌發(fā)必不可少的條件之一，而吸取足夠的水分是種子能夠獨(dú)立生活的第一步[9]，也是關(guān)鍵的一步。在用自來水沖的過程中，水的流速應(yīng)適中，且應(yīng)使種子都與水接觸，否則會(huì)影響種子的發(fā)芽率；在種子萌發(fā)的過程中，會(huì)有部分的種子腐爛變黑，可能是結(jié)實(shí)期種子受病蟲危害[10]所導(dǎo)致的。在剝?nèi)シN皮的過程中，注意不要傷到胚乳，因?yàn)榕呷槭欠N子集中養(yǎng)料的地方，而且種子在脫離胚乳的環(huán)境中，即使在適于胚生長(zhǎng)的條件下，仍不能生長(zhǎng)與分化，這充分證明了胚本身也是休眠的[11]；同時(shí)更要注意的是不要傷到胚，因?yàn)榕邔?duì)于種子來說非常重要，將來會(huì)發(fā)育成植物的器官。

關(guān)于種子的消毒劑有很多種，其中升汞的消毒效果最好[12]，但由于升汞毒性較大，因此本文選用NaClO溶液進(jìn)行消毒。種子的生活力與發(fā)芽率有明確的相關(guān)性[13]，隨著NaClO溶液濃度的增加，進(jìn)而影響種子的生活力，導(dǎo)致種子萌發(fā)率降低；同時(shí)NaClO溶液的濃度越大，對(duì)霉菌細(xì)菌等微生物的生長(zhǎng)起抑制作用，從而起到殺菌的效果；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，NaClO溶液會(huì)破壞細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)入細(xì)胞，影響酶的活性，甚至使種子完全失活，從而影響種子的萌發(fā)率。不同濃度的NaClO溶液對(duì)白術(shù)種子處理不同的時(shí)間后，獲得的無菌苗生長(zhǎng)情況如圖2所示。而不同消毒條件對(duì)幼苗后續(xù)生長(zhǎng)的影響，還有待于作進(jìn)一步的研究。

圖2 無菌苗生長(zhǎng)情況

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（責(zé)編：張宏民）