劉春利，劉曉偉，肖丹娜，高輝

（1.天津市口腔醫(yī)院正畸科，天津300041；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，天津300162）

有些正畸治療尤其功能矯形治療或者正畸正頜聯(lián)合治療的病例，在治療后不僅硬組織發(fā)生改建，相應(yīng)的軟組織也需要發(fā)生適應(yīng)性改變，從而適應(yīng)新的功能環(huán)境。頜面部肌肉結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性改建是這些治療成功的一個關(guān)鍵因素[1-2]。機械牽張刺激對頜面部肌肉改建的影響與治療效果的維持關(guān)系密切，因此摸索合適的機械牽張刺激對于治療效果以及輔助矯治裝置的研發(fā)有重要意義。肌細胞增強因子MEF2是一種調(diào)節(jié)肌肉特異性轉(zhuǎn)錄的基因，可以激活多種肌肉相關(guān)基因的表達，從而對肌肉組織的分化、維持和再生起重要作用[3]。MEF2A是其在骨骼肌中主要表達的亞型之一[4]，對MEF2A的研究是對骨骼肌細胞應(yīng)答機制研究的重要組成部分。為了模擬機械牽張力對頜面部肌肉作用，本實驗應(yīng)用四點彎曲細胞加力裝置對C2C12細胞施加不同時間段相同力度的機械牽張刺激，并通過實時熒光定量PCR檢測加力刺激后C2C12細胞MEF2A的基因表達規(guī)律，初步探索0.5 Hz，加力板變形量2 000μstrain的牽張力對骨骼肌細胞的影響，為探索功能矯治的細胞及分子生物學(xué)機制提供實驗依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 細胞系和主要試劑及儀器 C2C12細胞，DMEM/F12培養(yǎng)基，新生小牛血清(成都哈里生物工程有限公司 )，CO2孵箱（Forma Scientific.Inc.美國），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLY MPUS IX70），F(xiàn)orcel四點彎曲加力裝置（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院正畸與成都電子科技大學(xué)聯(lián)合研制），F(xiàn)TC2000實時熒光定量基因擴增儀（加拿大楓嶺公司），Trizol（美國MRC公司），RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit（立陶宛 MBI公司），Gel Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司），引物合成及探針修飾（上海生物工程有限公司）。

1.2 小鼠成肌細胞株C2C12培養(yǎng)及加力

1.2.1 成肌樣細胞株C2C12的傳代培養(yǎng) 將成肌樣細胞株C2C12按1×107/L的密度，接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理的中號玻璃培養(yǎng)瓶中，加入約10mL含10%新生小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于CO2孵箱(37℃，50mL/LCO2)。當(dāng)C2C12細胞生長形成單層，鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時，在無菌條件下傳代。用PBS液清洗培養(yǎng)瓶3次，加入25 g/L胰酶和22 g/LEDTA，室溫消化3～5min，加入含有10%新生小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞制成細胞懸液，按1×107/L密度分別置于各培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)隔天換液。

1.2.2 實驗分組 將實驗細胞分兩大組：第1組為空白對照組，第2組為加力組，每組按不同時段加力 1、2、4、8、12 h，每實驗時段收集 3 個樣本。

1.2.3 四點彎曲加力裝置對C2C12細胞加力 將BD Falcon公司的75 cm2藍蓋斜頸細胞培養(yǎng)瓶從中間剖開，取細胞常規(guī)培養(yǎng)時用的底面（厚度1.15 mm），分成3 cm×8 cm大小兩塊，周緣平滑四角圓鈍，以避免加力過程中的應(yīng)力集中。洗凈加力用細胞培養(yǎng)板，滅菌后接種細胞。采用傳代后的C2C12細胞，按2×105密度接種于加力板上(實驗組和對照組同時種板)，然后將其放入培養(yǎng)皿中，貼壁6 h后加入含100mL/L小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，再將培養(yǎng)基換為無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以同步化C2C12的細胞周期。采用Forcel四點彎曲體外細胞力學(xué)加載裝置對接種在加力板上的成肌樣細胞進行加力，頻率0.5Hz，加力板變形量為2 000μstrain，對細胞按不同時間段施加周期性牽張力。各加力組重復(fù)3次（n＝3），加力結(jié)束后分別收獲細胞。

1.3 樣本采集 以PBS沖洗加力后細胞，無菌濾紙吸凈多余PBS液，然后原位裂解細胞，嚴(yán)格按照Invitrogen公司的TRIZOL試劑說明書提取RNA，并收取RNA樣本置于經(jīng)DEPC水處理過的1.5mL離心管中，存放于-20攝氏度。

1.4 RT-PCR檢測MEF2A-mRNA的表達

1.4.1 引物設(shè)計與合成 MEF2A上游引物：5′－CACGCTACATAGAAATGTGT－3′，下游引物：5′－CTTGAGTTTACAAATCCATT－3′，探針：CTGTAGTGCTCAACATCCCAC，該產(chǎn)物產(chǎn)生144bpcDNA片段；ATCB：上游引物：5′－GAAGATCAAGATCATTGCTCCT－3′，下游引物：5′－TACTCCTGCTTGCTGATCCA－3′，探針：5′－ CTGTCCACCTTCCAGCAGA－3′，該產(chǎn)物產(chǎn)生111BP cDNA片段。

1.4.2 總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄 在紫外分光光度計上測定RNA的濃度和純度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛MBI公司）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4.3 實時熒光定量PCR 以cDNA為模板進行PCR擴增，30μL反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑：10×buffer3 μL，MgCl2(25mmol)3 μL，dNTP(25mmol)0.36 μL,PCR Forward Primer（10 μmol）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL，探針（10 μmol/L）0.6 μL，Template 0.3 μL，ddH2O 18.74 μL。兩步法PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)程序：預(yù)變性：94℃、2min 1個循環(huán)；PCR 反應(yīng)：94 ℃、20 s，46 ℃、20 s，60 ℃、30 s 45 個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件包，采用t檢驗以及單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為有顯著性差別。

2 結(jié)果

2.1 實際ACTB內(nèi)參和MEF2A相對分子質(zhì)量條帶 MEF2A與內(nèi)參照ACTB的實際電泳條帶和理論擴增條帶基本一致，說明二者的實際擴增相對分子質(zhì)量與理論值基本相符。凝膠電泳檢查結(jié)果見圖1。同時，總RNA提取完整無降解，滿足后續(xù)實驗的要求。見圖2。

圖1 ACTB和MEF2A擴增產(chǎn)物電泳條帶Fig 1 Electrophoresisbanding amplification productsof ACTB and MEF2A

2.2 對照組與加力組MEF2A基因表達比較 采用t檢驗，相同時間段加力組與空白對照組相比，MEF2A基因表達量未見明顯變化（P＞0.05），采用單因素方差分析對加力組不同時間段MEF2A基因的表達進行比較，發(fā)現(xiàn)加力后各時間段MEF2A基因表達強度未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 兩組各時間點牽張力誘導(dǎo)MEF2Am RNA表達（Ct值）比較Tab1 CompareMEF2A geneexpression affected by strain forcebetween different timegroups

組別 樣本數(shù) 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h空白組 15 6.90±0.605 6.45±0.491 6.91±0.314 6.99±0.340 6.01±0.439加力組 15 6.31±0.464 6.29±0.536 6.06±0.578 6.59±0.528 6.33±0.489

3 討論

在口周肌肉受到的各種刺激當(dāng)中，張力刺激尤為重要。因為口周肌肉附著在頜骨上，當(dāng)咀嚼時或是戴用矯形裝置時，頜面部骨骼肌會因被拉伸而處于張力作用下，矯形治療中和治療后頜面部骨骼肌改建及其穩(wěn)定性與張力刺激有關(guān)。MEF2A廣泛存在于骨骼肌中，其DNA結(jié)合活性在骨骼肌中高度表達[5]，參與調(diào)控肌細胞的分化和肌肉特異性蛋白表達[6-7]，張力刺激對于MEF2A影響的研究是研究張力對于骨骼肌改建影響的重要組成部分。

本研究中采用四點彎曲細胞力學(xué)加載儀，此裝置采用梁變形原理，通過數(shù)控步進電機使細胞培養(yǎng)板發(fā)生形變，以此對培養(yǎng)板表面的細胞產(chǎn)生恒定的周期性張力。曾有學(xué)者對細胞的多種施力方式進行研究[8-9]，細胞可以耐受的應(yīng)變量約1 000μstrain～4 000μstrain[10]。本實驗中采用低頻率（0.5Hz）2000μ strain大小的周期性張力，對C2C12細胞進行加力，加力后用顯微鏡觀察加力板上的細胞，此力值在細胞所能承受力值范圍內(nèi)，而且該力下細胞的貼壁及生長情況良好，脫落率極低，符合本實驗的要求。

以往研究表明周期性牽張力作為一種有效刺激對牙周膜細胞、骨髓破骨細胞等均有影響[11-12]，而其對骨骼肌細胞的影響也是近年來的研究熱點。為了探明周期性牽張力對骨骼肌改建的細胞學(xué)機制，本研究選擇MEF2A作為研究對象，MEF2A是成肌因子中的一個重要分型，此次研究也為后續(xù)研究周期性牽張力對其它成肌因子的影響提供實驗依據(jù)。對C2C12細胞在周期性張力作用下，MEF2A基因表達檢測發(fā)現(xiàn)，加力12 h以內(nèi)MEF2A基因表達量與對照組比較和加力組各時間段橫向比較均未見統(tǒng)計學(xué)差異，其表達量沒有隨時間延長而增加，各相鄰加力時間之間MEF2A基因表達量未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，提示周期性牽張力在12 h以內(nèi)不能以改變MEF2A基因表達的形式影響骨骼肌細胞。在矯形治療中，短時間的加力過程可能不足以引起頜面部骨骼肌的明顯改建，需要延長治療中骨骼肌的受力時間，同時佐證了戴用功能矯治器建議每天戴用14 h以上甚至全天戴用[13]，才能保證治療效果，并需要延長治療滿意后的效果保持時間。本次實驗研究采用0.5Hz加力頻率，型變量為2 000μstrain，在生理范圍內(nèi)其他頻率和加力形變量對于C2C12的MEF2A基因表達的影響需進一步研究。

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