田建平 胡遠(yuǎn)艷 張吉貞 張名楠 陳國良

摘要

[目的]對海南和廣東2省6個(gè)產(chǎn)地的華南忍冬分子地理標(biāo)識及生態(tài)因子的關(guān)系進(jìn)行研究，以尋找其內(nèi)在聯(lián)系。[方法] 應(yīng)用主成分分析和數(shù)量分類技術(shù)對華南忍冬6個(gè)產(chǎn)地的溫度、水分、光照、經(jīng)緯度等地理生態(tài)因子進(jìn)行分析，通過psbAtrnH序列測序和分子指紋圖譜分析，尋找不同產(chǎn)地的差異。[結(jié)果]可以將6個(gè)產(chǎn)區(qū)分為3部分，其中屯昌和瓊中產(chǎn)區(qū)以年均降水量貢獻(xiàn)值最大，韶關(guān)產(chǎn)區(qū)則以7月均最高溫、經(jīng)緯度貢獻(xiàn)值最大;海口、文昌和湛江則以年均氣溫、年均相對濕度、1月氣溫等貢獻(xiàn)值最大。基于psbAtrnH 序列對不同產(chǎn)地華南忍冬進(jìn)行分子指紋圖譜鑒別及分析，結(jié)果表明，利用 psbAtrnH 序列比對分析發(fā)現(xiàn)，華南忍冬不同產(chǎn)地間序列位點(diǎn)存在較大差異，保守位點(diǎn)有267 bp，占序列總長度的60.2%; 變異位點(diǎn)有182 bp，占序列總長度的39.8%， NJ tree 分析表明，華南忍冬2省6產(chǎn)區(qū)可分為3支，與基于地理生態(tài)因子的分類具有很強(qiáng)的相關(guān)性。[結(jié)論]該研究為進(jìn)一步研究山銀花的生態(tài)型和品質(zhì)變異的生物學(xué)本質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 華南忍冬;生態(tài)因子;psbAtrnH序列;指紋圖譜

中圖分類號 S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-038-03

Study on the Correlation between Gene Sequence Characteristics of psbAtrnH and Ecological Factors of ?Lonicera confusa

TIAN Jianping¹，HU Yuanyan²，ZHANG Jizhen² ?et al

（1.Department of paharmacy，Hainan medical college，Haikou，Hainan 571199 ;2.Key Laboratory for Tropical Biological Resources，MOE，Hainan University，Haikou，Hainan 570228;3.Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou，Hainan 570228）

Abstract ? [Objective]To discuss the relationship between molecular geographical indications and ecological factors of L.confusa， ?the ?relative datas from the six regions of Hainan and Guangdong province were studied.[Method]By using of principal component analysis（PCA） and quantitative classification technology， ?geographical and ecological factors （ including temperature，moisture，illumination，latitude and longitude，etc） from ?six areas ?of L.confusa was analyzed. Through psbAtrnH sequencing and molecular fingerprintiny analysis， the difference from different habitats was found.[Result] The results showed that the six regions could be divided into three parts，and the Tunchang and Qiongzhong County have the maximum contribution value with the average annual rainfall ，Shaoguan region have the maximum contribution value with ?the most high temperature in July，latitude and longitude. Haikou，Wenchang and Zhanjiang have the maximum contribution value with the annual temperature，relative humidity，air temperature of January，etc.Molecular fingerprint identification and analysis of L.confusa ?based on the psbAtrnH sequences had been researched in different areas，the results had been showed that，there had existed sequence differences between different habitats， and the conservative sites were 267 bp，the mutation locus were 182 bp; NJ tree analysis showed that six areas of ?L.confusa in southern China can be divided into three branches too，and it had ?the strong correlation ?between the results of classification based on geographical and ecological factors.[Conclusion] The study ? ?provided the scientific basis for the biological nature for the further studies of variation of ecotypes and quality of Lonicerae flos.

Key words ?Lonicera confuse; Ecological factors; psbAtrnH; Fingerprint

基金項(xiàng)目 海南省教育廳科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Hjkj2012-29）。

作者簡介 田建平（1972- ），男，湖南常德人，副教授，從事中藥資源學(xué)研究。

收稿日期 20141204

道地藥材品質(zhì)特征及其成因的系統(tǒng)研究一直是中藥材科學(xué)研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一^[1]。由于遺傳和生態(tài)因子等因素的共同作用導(dǎo)致種內(nèi)變異是中藥材品質(zhì)不同的主要原因^[2]。由于其所具有的重要性，目前關(guān)于藥材地理分布與遺傳的相關(guān)性研究逐漸增多^[3]。

華南忍冬[Lonicera confusa （Sweet） DC.]為忍冬科多年生藤本植物，主要分布在廣東、廣西、海南等地，花供藥用，為華南地區(qū)“山銀花”中藥材的主要品種，有清熱解毒之功效^[4]。莫愛瓊等^[5]利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）技術(shù)分析了華南忍冬的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)其具有較高水平的遺傳多樣性。居群間遺傳分化程度較高（Gst=0.383 9）;地理距離與遺傳距離之間具有顯著相關(guān)性，表明地理隔離效應(yīng)是導(dǎo)致居群間遺傳分化的重要因素。psbA-trnH 基因間隔區(qū)居于編碼光合系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心DⅠ蛋白的psbA 基因和編碼tRNA 組氨酸的trnH 基因之間，被認(rèn)為是葉綠體基因組中進(jìn)化速率最快的基因間隔區(qū)之一。目前，已將psbA-trnH 序列分析用于連翹〔Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl〕3 個(gè)居群和相關(guān)物種的遺傳多樣性研究^[6]。前期研究表明，華南忍冬不同產(chǎn)地同一類化學(xué)成分含量差異也較大^[7]，筆者運(yùn)用主成分分析（PCA）和psbA-trnH基因序列差異聚類判別方法對分布在海南和廣東兩地的華南忍冬地理分布格局差異及分子地理特點(diǎn)進(jìn)行研究，以深入闡明山銀花（華南忍冬）中藥資源品質(zhì)差異內(nèi)因，因而對促進(jìn)山銀花品質(zhì)提升具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

于2013年分別從海南、廣東等地進(jìn)行樣品采集，樣品由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院田建平副教授鑒定為忍冬科植物華南忍冬[Lonicera confusa （Sweet） DC.]。憑證標(biāo)本保存于海南醫(yī)學(xué)院中藥標(biāo)本館。

NaCl、CTAB、EDTA、Tris、氯仿、異戊醇、異丙醇均為分析純，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR 反應(yīng)試劑購自于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生態(tài)因子數(shù)據(jù)獲取。

通過查詢采樣點(diǎn)附近各氣象站所記錄的氣象數(shù)據(jù)，所提取的生態(tài)因子包括年均溫、1月均溫、1月平均最低溫、7月均溫、7月平均最高溫、年均相對濕度、年均日照時(shí)數(shù)和年均降水量、經(jīng)度、緯度等（表1），利用生態(tài)學(xué)軟件canoco 5.0進(jìn)行PCA分析，測定其PCA得分圖與載荷圖。

1.2.2 psbA-trnH序列。

1.2.2.1 基因組總DNA 提取。

每份樣品取30～40 mg，液氮碾磨成細(xì)末，采用改良CTAB方法提取樣品DNA。異戊醇沉淀，晾干，適量ddH₂O溶解，用PCR Products Purification kit（上海 Sangon 公司）純化后，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 華南忍冬采集樣地生態(tài)因子

位點(diǎn)經(jīng)度

E緯度

N年均

氣溫∥℃1月

均溫∥℃1月均最

低氣溫∥℃7月

均溫∥℃7月均最

高溫∥℃年均相

對濕度∥%年均日

照時(shí)數(shù)∥h年均降

水量∥mm

?？?10°19′20°10′24.217.214.628.433.184.802 069.51 664.0

文昌110°72′19°61′23.917.814.828.132.487.001 953.81 721.6

屯昌110°10′19°36′23.219.816.628.432.384.002 000.02 350.0

瓊中109°83′19°05′22.516.512.828.533.084.601 743.12 444.0

湛江110°23′21°11′23.519.514.129.132.085.001 817.01 313.2

韶關(guān)113°33′24°48′19.715.57.028.034.077.001 499.71 522.0

1.2.2.2 psbA-trnH序列的PCR擴(kuò)增及測序。

psbA-trnH 序列引物psbA3′f和trnHf_05分別為GTTATGCATGAACGTAATGCTC和CGCGCATGGTGGATTCAATCC。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI型PCR 儀上進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積20 μl，含30 ng 模板DNA、10 × PCR buffer（含Mg²⁺）2 μl、10 mmol/L dNTPs 0.3 μl、5 μmol/L 引物2 μl和5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.2 μl，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μl。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，70 ℃延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán); 最后于72 ℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化后使用引物直接進(jìn)行雙向測序，測序由上海華大基因有限公司完成。

1.3 序列數(shù)據(jù)的處理

DNA序列的排序用DNAMAN軟件完成，并輔以人工校對，排序后的序列使用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 6.06（molecular evolutionary genetic analysis）進(jìn)行分析，以Kimura—2參數(shù)計(jì)算遺傳距離，采用鄰接法（neighbor—joining，NJ）與自展檢驗(yàn)（Bootstrap）1000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 華南忍冬分布區(qū)域地理氣候因子分析

通過對海南、廣東華南忍冬分布區(qū)附近各氣象站點(diǎn)提取生態(tài)因子，利用canoco軟件對主產(chǎn)區(qū)海南、廣東的生態(tài)因子進(jìn)行PCA分析，得到PCA得分圖和載荷圖（圖1）。由圖1可知， 由于地理、氣候等因子的不同，海南、廣東6個(gè)分布區(qū)明顯分為3種類型，其中海南產(chǎn)區(qū)屯昌、瓊中以年均降水量貢獻(xiàn)值最大，而海南文昌、?？?、廣東湛江以年均相對濕度、年均氣溫、7月均溫、1月最低均溫的貢獻(xiàn)值最大，而生態(tài)因子7月均最高溫度、經(jīng)度、緯度則對廣東韶關(guān)產(chǎn)區(qū)的貢獻(xiàn)值大，正是這種生態(tài)因子的差異，導(dǎo)致華南忍冬海南和廣東兩大產(chǎn)區(qū)呈現(xiàn)不同的氣候地理生態(tài)型。

圖1 華南忍冬生態(tài)因子PCA得分圖與載荷圖

2.2 不同產(chǎn)地華南忍冬 psbAtrnH 序列特征比較

結(jié)合從Genbank中取得的華南忍冬湛江和韶關(guān)產(chǎn)的psbAtrnH序列（KM258576.1和KM258575.1），加上海南不同產(chǎn)地華南忍冬psbAtrnH序列變異位點(diǎn)分析， 運(yùn)用DNAMAN軟件對測序得到的序列文件進(jìn)行拼接、比對。 6個(gè)不同地域華南忍冬psbA-trnH 序列的長度為451～552 bp，排序后兩端切平獲得的序列長度為443 bp，當(dāng)空缺（gap） 始終作缺失（missing） 處理時(shí)，保守位點(diǎn)有267 bp，占序列總長度的60.2%; 變異位點(diǎn)有182 bp，占序列總長度的39.8%，變異類型主要為堿基缺失和替換（圖2）。

運(yùn)用MEGA6.06軟件，通過序列比對分析，建立華南忍冬不同產(chǎn)地鄰接樹，可見華南忍冬2省6個(gè)產(chǎn)地明顯分為3支，其中?？凇⒄拷?、文昌聚類為一支，韶關(guān)為一支，而海南瓊中、屯昌聚為另一支（圖3）。

3 討論

受到特定自然生態(tài)環(huán)境的制約和影響，同一種中藥材在不同產(chǎn)地長期趨異適應(yīng)形成較為穩(wěn)定的生態(tài)型，并在基因表達(dá)、生化等表型上表現(xiàn)差異，而這種差異是產(chǎn)生藥材品質(zhì)優(yōu)劣和療效差異的實(shí)質(zhì)^[2]。 作為南藥的一種，華南忍冬（山銀花）產(chǎn)區(qū)主要分布在海南、廣東、廣西等地，分布地理環(huán)境有很大差異。研究表明，華南忍冬即使在同一產(chǎn)區(qū)其綠原酸化學(xué)成分含量也有較大差異^[8] ，該差異的形成是由于與其分布的廣西特殊石灰?guī)r環(huán)境有關(guān)。該研究通過對地理分布格局具有較大差異的其他2個(gè)道地產(chǎn)區(qū)的華南忍冬進(jìn)行分子地理標(biāo)識及氣候生態(tài)因子的進(jìn)一步研究，證實(shí)了氣候因子在藥材生產(chǎn)布局中的重要性。

由于地理隔離效應(yīng)，加上包括地理環(huán)境特征在內(nèi)的生態(tài)因子等因素的影響，華南忍冬存在種內(nèi)分化，進(jìn)一步導(dǎo)致不同地域的華南忍冬植物體內(nèi)次生代謝反應(yīng)的強(qiáng)度和途徑產(chǎn)生差異，最終對藥材的品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。莫愛瓊等^[5]對華南忍冬居群遺傳多樣性的RAPD分析已證實(shí)華南忍冬存在種類分化，該研究從psbAtrnH序列的角度比較了華南忍冬在海南、廣東兩省的分子地理特征，結(jié)果表明，華南忍冬的psbAtrnH序列位點(diǎn)在廣東、海南兩省分布區(qū)具有一定范圍的堿基變異?；趐sbAtrnH序列差異的NJ樹聚類分析結(jié)果中，海南?？凇⑽牟?、湛江聚為一類，廣東韶關(guān)聚為一類，海南屯昌、瓊中聚為另一類。這與基于主成分分析基礎(chǔ)上的華南忍冬分布區(qū)的分析結(jié)果具有很強(qiáng)的相關(guān)性。該研究表明，植物遺傳特征與氣候因子影響具有密切的關(guān)系，有關(guān)肉蓯蓉生態(tài)型研究類似的結(jié)果也證明了上述關(guān)系^[9]。因此該研究對于今后進(jìn)一步研究華南忍冬的地理生態(tài)型具有重要的參考價(jià)值。

圖2 6個(gè)不同地域華南忍冬psbAtrnH 序列特征

圖3 基于6個(gè)不同地域華南忍冬psbAtrnH 序列特征基礎(chǔ)的NJ聚類圖

由于在海南華南忍冬為野生狀態(tài)分布，規(guī)?；N植基地主要分別在湛江等地，該研究結(jié)果不僅對于今后華南忍冬種植區(qū)在海南的合理布局具有重要的指導(dǎo)意義，而且對其他藥材的合理布局也有一定的參考價(jià)值。在此基礎(chǔ)上，今后更應(yīng)加強(qiáng)基于更多種類分子標(biāo)記的遺傳分析、藥材化學(xué)成分、氣候因子關(guān)系的研究，以進(jìn)一步深入探討華南忍冬道地藥材的

形成機(jī)理。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2015年

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