田建平 胡遠艷 張吉貞 張名楠 陳國良

摘要

[目的]對海南和廣東2省6個產(chǎn)地的華南忍冬分子地理標識及生態(tài)因子的關系進行研究，以尋找其內(nèi)在聯(lián)系。[方法] 應用主成分分析和數(shù)量分類技術對華南忍冬6個產(chǎn)地的溫度、水分、光照、經(jīng)緯度等地理生態(tài)因子進行分析，通過psbAtrnH序列測序和分子指紋圖譜分析，尋找不同產(chǎn)地的差異。[結(jié)果]可以將6個產(chǎn)區(qū)分為3部分，其中屯昌和瓊中產(chǎn)區(qū)以年均降水量貢獻值最大，韶關產(chǎn)區(qū)則以7月均最高溫、經(jīng)緯度貢獻值最大;?？凇⑽牟驼拷瓌t以年均氣溫、年均相對濕度、1月氣溫等貢獻值最大?；趐sbAtrnH 序列對不同產(chǎn)地華南忍冬進行分子指紋圖譜鑒別及分析，結(jié)果表明，利用 psbAtrnH 序列比對分析發(fā)現(xiàn)，華南忍冬不同產(chǎn)地間序列位點存在較大差異，保守位點有267 bp，占序列總長度的60.2%; 變異位點有182 bp，占序列總長度的39.8%， NJ tree 分析表明，華南忍冬2省6產(chǎn)區(qū)可分為3支，與基于地理生態(tài)因子的分類具有很強的相關性。[結(jié)論]該研究為進一步研究山銀花的生態(tài)型和品質(zhì)變異的生物學本質(zhì)提供科學依據(jù)。

關鍵詞 華南忍冬;生態(tài)因子;psbAtrnH序列;指紋圖譜

中圖分類號 S188 ?文獻標識碼

A ?文章編號 0517-6611（2015）03-038-03

Study on the Correlation between Gene Sequence Characteristics of psbAtrnH and Ecological Factors of ?Lonicera confusa

TIAN Jianping¹，HU Yuanyan²，ZHANG Jizhen² ?et al

（1.Department of paharmacy，Hainan medical college，Haikou，Hainan 571199 ;2.Key Laboratory for Tropical Biological Resources，MOE，Hainan University，Haikou，Hainan 570228;3.Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou，Hainan 570228）

Abstract ? [Objective]To discuss the relationship between molecular geographical indications and ecological factors of L.confusa， ?the ?relative datas from the six regions of Hainan and Guangdong province were studied.[Method]By using of principal component analysis（PCA） and quantitative classification technology， ?geographical and ecological factors （ including temperature，moisture，illumination，latitude and longitude，etc） from ?six areas ?of L.confusa was analyzed. Through psbAtrnH sequencing and molecular fingerprintiny analysis， the difference from different habitats was found.[Result] The results showed that the six regions could be divided into three parts，and the Tunchang and Qiongzhong County have the maximum contribution value with the average annual rainfall ，Shaoguan region have the maximum contribution value with ?the most high temperature in July，latitude and longitude. Haikou，Wenchang and Zhanjiang have the maximum contribution value with the annual temperature，relative humidity，air temperature of January，etc.Molecular fingerprint identification and analysis of L.confusa ?based on the psbAtrnH sequences had been researched in different areas，the results had been showed that，there had existed sequence differences between different habitats， and the conservative sites were 267 bp，the mutation locus were 182 bp; NJ tree analysis showed that six areas of ?L.confusa in southern China can be divided into three branches too，and it had ?the strong correlation ?between the results of classification based on geographical and ecological factors.[Conclusion] The study ? ?provided the scientific basis for the biological nature for the further studies of variation of ecotypes and quality of Lonicerae flos.

Key words ?Lonicera confuse; Ecological factors; psbAtrnH; Fingerprint

基金項目 海南省教育廳科學基金資助項目（Hjkj2012-29）。

作者簡介 田建平（1972- ），男，湖南常德人，副教授，從事中藥資源學研究。

收稿日期 20141204

道地藥材品質(zhì)特征及其成因的系統(tǒng)研究一直是中藥材科學研究中的熱點和難點之一^[1]。由于遺傳和生態(tài)因子等因素的共同作用導致種內(nèi)變異是中藥材品質(zhì)不同的主要原因^[2]。由于其所具有的重要性，目前關于藥材地理分布與遺傳的相關性研究逐漸增多^[3]。

華南忍冬[Lonicera confusa （Sweet） DC.]為忍冬科多年生藤本植物，主要分布在廣東、廣西、海南等地，花供藥用，為華南地區(qū)“山銀花”中藥材的主要品種，有清熱解毒之功效^[4]。莫愛瓊等^[5]利用隨機擴增多態(tài)性（RAPD）技術分析了華南忍冬的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)其具有較高水平的遺傳多樣性。居群間遺傳分化程度較高（Gst=0.383 9）;地理距離與遺傳距離之間具有顯著相關性，表明地理隔離效應是導致居群間遺傳分化的重要因素。psbA-trnH 基因間隔區(qū)居于編碼光合系統(tǒng)Ⅱ反應中心DⅠ蛋白的psbA 基因和編碼tRNA 組氨酸的trnH 基因之間，被認為是葉綠體基因組中進化速率最快的基因間隔區(qū)之一。目前，已將psbA-trnH 序列分析用于連翹〔Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl〕3 個居群和相關物種的遺傳多樣性研究^[6]。前期研究表明，華南忍冬不同產(chǎn)地同一類化學成分含量差異也較大^[7]，筆者運用主成分分析（PCA）和psbA-trnH基因序列差異聚類判別方法對分布在海南和廣東兩地的華南忍冬地理分布格局差異及分子地理特點進行研究，以深入闡明山銀花（華南忍冬）中藥資源品質(zhì)差異內(nèi)因，因而對促進山銀花品質(zhì)提升具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

于2013年分別從海南、廣東等地進行樣品采集，樣品由海南醫(yī)學院藥學院田建平副教授鑒定為忍冬科植物華南忍冬[Lonicera confusa （Sweet） DC.]。憑證標本保存于海南醫(yī)學院中藥標本館。

NaCl、CTAB、EDTA、Tris、氯仿、異戊醇、異丙醇均為分析純，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR 反應試劑購自于寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生態(tài)因子數(shù)據(jù)獲取。

通過查詢采樣點附近各氣象站所記錄的氣象數(shù)據(jù)，所提取的生態(tài)因子包括年均溫、1月均溫、1月平均最低溫、7月均溫、7月平均最高溫、年均相對濕度、年均日照時數(shù)和年均降水量、經(jīng)度、緯度等（表1），利用生態(tài)學軟件canoco 5.0進行PCA分析，測定其PCA得分圖與載荷圖。

1.2.2 psbA-trnH序列。

1.2.2.1 基因組總DNA 提取。

每份樣品取30～40 mg，液氮碾磨成細末，采用改良CTAB方法提取樣品DNA。異戊醇沉淀，晾干，適量ddH₂O溶解，用PCR Products Purification kit（上海 Sangon 公司）純化后，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 華南忍冬采集樣地生態(tài)因子

位點經(jīng)度

E緯度

N年均

氣溫∥℃1月

均溫∥℃1月均最

低氣溫∥℃7月

均溫∥℃7月均最

高溫∥℃年均相

對濕度∥%年均日

照時數(shù)∥h年均降

水量∥mm

海口110°19′20°10′24.217.214.628.433.184.802 069.51 664.0

文昌110°72′19°61′23.917.814.828.132.487.001 953.81 721.6

屯昌110°10′19°36′23.219.816.628.432.384.002 000.02 350.0

瓊中109°83′19°05′22.516.512.828.533.084.601 743.12 444.0

湛江110°23′21°11′23.519.514.129.132.085.001 817.01 313.2

韶關113°33′24°48′19.715.57.028.034.077.001 499.71 522.0

1.2.2.2 psbA-trnH序列的PCR擴增及測序。

psbA-trnH 序列引物psbA3′f和trnHf_05分別為GTTATGCATGAACGTAATGCTC和CGCGCATGGTGGATTCAATCC。擴增反應在ABI型PCR 儀上進行。擴增反應體系總體積20 μl，含30 ng 模板DNA、10 × PCR buffer（含Mg²⁺）2 μl、10 mmol/L dNTPs 0.3 μl、5 μmol/L 引物2 μl和5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.2 μl，用滅菌雙蒸水補足至20 μl。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，70 ℃延伸45 s，共30 個循環(huán); 最后于72 ℃延伸5 min。PCR 擴增產(chǎn)物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒進行純化，純化后使用引物直接進行雙向測序，測序由上海華大基因有限公司完成。

1.3 序列數(shù)據(jù)的處理

DNA序列的排序用DNAMAN軟件完成，并輔以人工校對，排序后的序列使用分子進化遺傳分析軟件MEGA 6.06（molecular evolutionary genetic analysis）進行分析，以Kimura—2參數(shù)計算遺傳距離，采用鄰接法（neighbor—joining，NJ）與自展檢驗（Bootstrap）1000次構建系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 華南忍冬分布區(qū)域地理氣候因子分析

通過對海南、廣東華南忍冬分布區(qū)附近各氣象站點提取生態(tài)因子，利用canoco軟件對主產(chǎn)區(qū)海南、廣東的生態(tài)因子進行PCA分析，得到PCA得分圖和載荷圖（圖1）。由圖1可知， 由于地理、氣候等因子的不同，海南、廣東6個分布區(qū)明顯分為3種類型，其中海南產(chǎn)區(qū)屯昌、瓊中以年均降水量貢獻值最大，而海南文昌、?？?、廣東湛江以年均相對濕度、年均氣溫、7月均溫、1月最低均溫的貢獻值最大，而生態(tài)因子7月均最高溫度、經(jīng)度、緯度則對廣東韶關產(chǎn)區(qū)的貢獻值大，正是這種生態(tài)因子的差異，導致華南忍冬海南和廣東兩大產(chǎn)區(qū)呈現(xiàn)不同的氣候地理生態(tài)型。

圖1 華南忍冬生態(tài)因子PCA得分圖與載荷圖

2.2 不同產(chǎn)地華南忍冬 psbAtrnH 序列特征比較

結(jié)合從Genbank中取得的華南忍冬湛江和韶關產(chǎn)的psbAtrnH序列（KM258576.1和KM258575.1），加上海南不同產(chǎn)地華南忍冬psbAtrnH序列變異位點分析， 運用DNAMAN軟件對測序得到的序列文件進行拼接、比對。 6個不同地域華南忍冬psbA-trnH 序列的長度為451～552 bp，排序后兩端切平獲得的序列長度為443 bp，當空缺（gap） 始終作缺失（missing） 處理時，保守位點有267 bp，占序列總長度的60.2%; 變異位點有182 bp，占序列總長度的39.8%，變異類型主要為堿基缺失和替換（圖2）。

運用MEGA6.06軟件，通過序列比對分析，建立華南忍冬不同產(chǎn)地鄰接樹，可見華南忍冬2省6個產(chǎn)地明顯分為3支，其中?？?、湛江、文昌聚類為一支，韶關為一支，而海南瓊中、屯昌聚為另一支（圖3）。

3 討論

受到特定自然生態(tài)環(huán)境的制約和影響，同一種中藥材在不同產(chǎn)地長期趨異適應形成較為穩(wěn)定的生態(tài)型，并在基因表達、生化等表型上表現(xiàn)差異，而這種差異是產(chǎn)生藥材品質(zhì)優(yōu)劣和療效差異的實質(zhì)^[2]。 作為南藥的一種，華南忍冬（山銀花）產(chǎn)區(qū)主要分布在海南、廣東、廣西等地，分布地理環(huán)境有很大差異。研究表明，華南忍冬即使在同一產(chǎn)區(qū)其綠原酸化學成分含量也有較大差異^[8] ，該差異的形成是由于與其分布的廣西特殊石灰?guī)r環(huán)境有關。該研究通過對地理分布格局具有較大差異的其他2個道地產(chǎn)區(qū)的華南忍冬進行分子地理標識及氣候生態(tài)因子的進一步研究，證實了氣候因子在藥材生產(chǎn)布局中的重要性。

由于地理隔離效應，加上包括地理環(huán)境特征在內(nèi)的生態(tài)因子等因素的影響，華南忍冬存在種內(nèi)分化，進一步導致不同地域的華南忍冬植物體內(nèi)次生代謝反應的強度和途徑產(chǎn)生差異，最終對藥材的品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。莫愛瓊等^[5]對華南忍冬居群遺傳多樣性的RAPD分析已證實華南忍冬存在種類分化，該研究從psbAtrnH序列的角度比較了華南忍冬在海南、廣東兩省的分子地理特征，結(jié)果表明，華南忍冬的psbAtrnH序列位點在廣東、海南兩省分布區(qū)具有一定范圍的堿基變異?；趐sbAtrnH序列差異的NJ樹聚類分析結(jié)果中，海南海口、文昌、湛江聚為一類，廣東韶關聚為一類，海南屯昌、瓊中聚為另一類。這與基于主成分分析基礎上的華南忍冬分布區(qū)的分析結(jié)果具有很強的相關性。該研究表明，植物遺傳特征與氣候因子影響具有密切的關系，有關肉蓯蓉生態(tài)型研究類似的結(jié)果也證明了上述關系^[9]。因此該研究對于今后進一步研究華南忍冬的地理生態(tài)型具有重要的參考價值。

圖2 6個不同地域華南忍冬psbAtrnH 序列特征

圖3 基于6個不同地域華南忍冬psbAtrnH 序列特征基礎的NJ聚類圖

由于在海南華南忍冬為野生狀態(tài)分布，規(guī)?；N植基地主要分別在湛江等地，該研究結(jié)果不僅對于今后華南忍冬種植區(qū)在海南的合理布局具有重要的指導意義，而且對其他藥材的合理布局也有一定的參考價值。在此基礎上，今后更應加強基于更多種類分子標記的遺傳分析、藥材化學成分、氣候因子關系的研究，以進一步深入探討華南忍冬道地藥材的

形成機理。

安徽農(nóng)業(yè)科學 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2015年

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