張雁林 毛麗君 李樹強(qiáng) 陳明 郭利霞 趙贊梅 關(guān)里 溫韜 趙金垣

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2015.03.004

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（30571551，81241060）

作者單位：100191 北京，北京大學(xué)第三醫(yī)院職業(yè)醫(yī)學(xué)研究中心（張雁林、毛麗君、李樹強(qiáng)、陳明、郭利霞、趙贊梅、關(guān)里、趙金垣）;首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院北京市肝病研究所（溫韜）

通信作者：趙金垣，Email：zhaojinyuan@sina.com

【摘要】目的 研究細(xì)胞外組蛋白是否是鹽酸吸入性急性肺損傷（ALI）發(fā)病過(guò)程中的重要炎癥介質(zhì)，是否可作為干預(yù)的靶標(biāo)。 方法 選取生理鹽水和4個(gè)濃度的鹽酸（0.01、0.1、0.3和0.5 mol/L）來(lái)研究小鼠吸入鹽酸與血漿組蛋白水平的相關(guān)性;選取吸入鹽酸后共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1、3、6、12、24和72 h）觀察組蛋白的變化規(guī)律;采用抗組蛋白中和抗體研究特異拮抗組蛋白對(duì)小鼠病死率、血?dú)夥治?、肺水腫、肺組織MPO活力、肺病理的影響。結(jié)果 小鼠吸入鹽酸后血漿中組蛋白水平明顯升高，而且吸入鹽酸濃度與血漿中組蛋白H4水平具有明顯的正相關(guān)性（r=0.874 6， P=0.031 7） ?？菇M蛋白H4中和抗體可減少病死率（P=0.034 5），血?dú)夥治鼋Y(jié)果有所改善，肺水腫、肺組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）活力、肺組織病理均有改變。結(jié)論 細(xì)胞外組蛋白是一種新的內(nèi)源性炎性介質(zhì)，在介導(dǎo)酸吸入性ALI中起重要作用;它既可作為反映損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)，還可作為干預(yù)治療的靶標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞外組蛋白;急性肺損傷;酸吸入;炎癥;中和抗體

Study in the role of extracellular histones in the pathogenesis of acute lung injury caused by acid aspiration

Zhang Yanlin， Mao Lijun， Li Shuqiang， Chen Ming， Guo Lixia， Zhao Zanmei， Guan Li， Wen Tao， Zhao Jinyuan.

Research Center of Occupational Medicine， Third Hospital of Peking University， Beijing 100191， China

Corresponding author：Zhao Jinyuan，Email：zhaojinyuan@sina.com

【Abstract】Objective To investigate the effects of extracellular histones as a major mediator and the target for intervention in the pathogenesis of ALI in the wake of acid aspiration. Methods The correlation of circulating histones and aspiratory acid was determined with normal saline and 4 different concentrations of acid （0.01 mol/L，0.1 mol/L，0.3 mol/L and 0.5 mol/L）. The dynamic change of circulating histones was observed at 6 intervals of 1，3，6，12，24 and 72 h after injury. The protection of anti-histone-4 antibody was assessed by survival rates， blood gas， lung edema， MPO activity and lung pathological change.Results After acid aspiration， extracellular histone H4 increased significantly. The circulating histone levels were closely correlative with the concentrations of aspiratory acid（r=0.874 6， P=0.031 7）. The anti-histone-4 antibody could decrease mortality （P=0.034 5） and improve blood gas， lung edema， MPO activity and lung pathological change. Conclusions The results showed that extracellular histones were not only the key mediators in the pathogenesis of ALI but also the target for intervention.

【Key words】Extracellular histones;Acute lung injury;Acid aspiration;Inflammation;Neutralizing antibody

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/ 急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS） 是以肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加所致的非心源性滲透性肺水腫和頑固性低氧血癥為特點(diǎn)的臨床綜合征[1-2]。ARDS屬于ALI的終末階段， 是重癥監(jiān)護(hù)病房的主要致死原因，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道其病死率高達(dá)40 %左右。ALI的主要病因包括感染、酸吸入以及嚴(yán)重創(chuàng)傷[3-4]。職業(yè)性化學(xué)性毒物吸入同樣是ALI的重要病因，如氯氣、氨氣、火災(zāi)中的煙霧等[5]。

目前對(duì)于ALI/ARDS的預(yù)防和治療，還沒(méi)有特效的手段，主要治療策略集中在機(jī)械通氣上。居高不下的病死率提示目前對(duì)ARDS的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，以致治療針對(duì)性不強(qiáng)[6-7]。因此深入研究ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制尤其是核心啟動(dòng)環(huán)節(jié)是重中之重。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)染色質(zhì)發(fā)生降解，釋放核小體入外周血，核小體再分解為組蛋白和DNA，少量組蛋白可迅速被單核巨噬細(xì)胞清除。但在嚴(yán)重?fù)p傷情況下，死亡細(xì)胞釋放大量組蛋白，超過(guò)了機(jī)體的清除能力，過(guò)剩的細(xì)胞外組蛋白便會(huì)作為內(nèi)源性損傷相關(guān)分子（damage-associated molecular pattern， DAMP）啟動(dòng)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致進(jìn)一步的損傷[8-10]。Xu等[11]研究表明，在小鼠感染模型中，組蛋白是導(dǎo)致細(xì)胞損傷和器官功能障礙的主要介質(zhì)，而且直接給小鼠注射組蛋白即可致死;而給予抗組蛋白特異抗體則有明顯的保護(hù)作用，其中起關(guān)鍵作用的是組蛋白H4。Abrams等[12]研究證實(shí)在創(chuàng)傷患者血漿中的組蛋白濃度與創(chuàng)傷損傷程度有明顯的正相關(guān)性，組蛋白可引起遠(yuǎn)隔部位器官的損傷，以肺損傷最常見(jiàn)。以上研究顯示細(xì)胞外組蛋白是重要的炎癥介質(zhì)，在ALI等炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用[13]。

本課題以鹽酸吸入引起的ALI小鼠模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究組蛋白在ALI發(fā)病過(guò)程中的變化規(guī)律以及與肺損傷程度的相關(guān)性，并且采用特異性抗組蛋白抗體進(jìn)行干預(yù)，以探討組蛋白是否是酸吸入性ALI的重要炎癥介質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

本研究中所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物管理和應(yīng)用委員會(huì)的許可。健康6～8周齡的成年雄性C57BL/6小鼠 （體質(zhì)量18～20 g） 購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 在實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)3 d使動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境，給予小鼠飼料并自由飲水。分析純鹽酸購(gòu)自北京化工廠。羊抗小鼠組蛋白H4多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;組蛋白H4檢測(cè)試劑盒（ELISA法）購(gòu)自武漢浩軒凱文生物技術(shù)公司;蛋白定量試劑盒（Bicinchoninic Acid，BCA法）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;髓過(guò)氧化物酶 （myeloperoxidase， MPO） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司;特異性抗組蛋白H4中和抗體（anti-H4）由北京佑安醫(yī)院溫韜博士惠贈(zèng)，非特異性的IgG抗體用作對(duì)照。

1.2 模型制備和動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食12 h但不禁水，用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，將小鼠保持在60°的頭高位，用9號(hào)注射針在環(huán)狀軟骨部位穿刺氣管緩慢注射鹽酸 （2 mL/kg 體質(zhì)量），時(shí)間不少于30 s以防窒息;對(duì)照組僅注射等量生理鹽水[14]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取生理鹽水、0.01、0.1、0.3和0.5 mol/L鹽酸5個(gè)濃度水平檢測(cè)酸吸入性ALI血漿中的組蛋白濃度;選取注射后1、3、6、12、24和72 h共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察血漿中的組蛋白質(zhì)量濃度變化。每組動(dòng)物6只，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取標(biāo)本檢測(cè)。

1.3 血漿中組蛋白含量測(cè)定

ELISA方法：在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，用枸櫞酸鈉抗凝的注射器穿刺小鼠腹主動(dòng)脈取血，經(jīng)低速離心后分離血漿，采用ELISA試劑盒檢測(cè)血漿中組蛋白H4的濃度。Western blot方法：用蛋白檢測(cè)試劑盒（BCA法）測(cè)定血漿中蛋白含量，等量的血漿蛋白（100 μg）與載樣緩沖液混合后，加入12% （w/v） SDS-聚丙烯酰胺凝膠后電泳，用吸光度法測(cè)定蛋白條帶的相對(duì)亮度。

1.4 血?dú)夥治?/p>

插入肝素化的腹主動(dòng)脈導(dǎo)管取小鼠頸動(dòng)脈血0.3 mL，在37 ℃條件下用Ciba Corning-170型血?dú)夥治鰞x進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 肺組織MPO活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)程序結(jié)束后，迅速取下小鼠的左下肺葉，加入生理鹽水進(jìn)行勻漿并離心，取上清液。加入MPO檢測(cè)試劑，用1601型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（Shimadzu， Japan） 在460 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量的比值的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)程序結(jié)束后，迅速取下小鼠的右上肺葉，用生理鹽水沖洗除去黏有的血污，再用組織試紙吸去附著的生理鹽水，稱濕質(zhì)量。然后把標(biāo)本放在60 ℃的恒溫干燥箱中72 h，稱干質(zhì)量。肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量的比值作為肺水腫程度的指標(biāo)。

1.7 肺組織病理學(xué)檢測(cè)

取自小鼠右下肺葉的組織浸泡在10%甲醛溶液中24 h，用石蠟包埋，切成4 μm的切片，經(jīng)HE染色。根據(jù)下列情況對(duì)顯微鏡下的損傷評(píng)分[15]：出血、間質(zhì)水腫、壞死、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和肺膨脹不全。肺損傷的嚴(yán)重程度依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)判斷：基本無(wú)損傷，0分;損傷區(qū)域小于25%，1分;損傷區(qū)域小于50%，2分;損傷區(qū)域小于75%，3分;彌漫性損傷，4分。每張病理切片隨機(jī)選取3個(gè)顯微視野。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。總體的組間差異用方差分析計(jì)算，與同一組比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)，組內(nèi)兩組間的比較用Student-Newman-Keuls計(jì)算。動(dòng)物生存分析用log-rank檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Pearson檢驗(yàn)（GraphPad Software， V5）。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

在劑量-反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)鹽酸吸入濃度可直接影響小鼠肺損傷程度：0.01 mol/L濃度組損傷輕微，小鼠均存活;0.1 mol/L濃度組出現(xiàn)明顯的呼吸困難如呼吸急促、皮膚發(fā)紺，有2只小鼠于24 h死亡;0.3 mol/L濃度組損傷嚴(yán)重，5只小鼠于24 h內(nèi)死亡;0.5 mol/L濃度組損傷最重，全部6只小鼠均于24 h內(nèi)死亡。

2.2 小鼠酸吸入后血漿中的細(xì)胞外組蛋白變化

如圖1A所示，小鼠吸入鹽酸后1 h，血漿中組蛋白H4濃度開(kāi)始增加，在3～6 h明顯升高，在約12 h達(dá)到峰值，以后逐漸下降，72 h仍高于正常范圍。與對(duì)照組相比，小鼠吸入鹽酸3、6、12 h后，血漿中組蛋白H4濃度升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;吸入鹽酸24 h后，仍差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而吸入鹽酸1 h和72 h后，血漿中組蛋白H4濃度雖升高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠血漿中組蛋白的變化除用ELISA方法檢測(cè)外，Western blot同樣證實(shí)血漿中組蛋白的上述變化規(guī)律（圖1B）。而且小鼠吸入鹽酸的濃度越高，血中組蛋白H4的濃度越高，二者具有明顯的正相關(guān)性（圖1C）。在0.01 mol/L至0.5 mol/L濃度范圍內(nèi)，血漿中組蛋白水平與吸入鹽酸濃度的相關(guān)系數(shù)r為0.874 6， 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031 7） 。

2.3 抗組蛋白H4抗體對(duì)致死濃度鹽酸吸入病死率的影響

小鼠吸入致死濃度鹽酸（0.3 mol/L， 2 mL/kg）后出現(xiàn)明顯的呼吸窘迫癥狀，未經(jīng)干預(yù)的小鼠在24 h內(nèi)全部死亡。而在酸吸入損傷前，經(jīng)尾靜脈注射給予anti-H4中和抗體預(yù)處理可降低病死率，小劑量（2.5～5 mg/kg）中和抗體保護(hù)作用不明顯（結(jié)果未顯示），大劑量中和抗體（10～20 mg/kg）可明顯降低病死率（與對(duì)照抗體組相比，P=0.034 5）。但是無(wú)中和作用的對(duì)照抗體IgG在小劑量和大劑量時(shí)均無(wú)保護(hù)作用（圖2）。以上結(jié)果提示anti-H4中和抗體可通過(guò)拮抗炎癥介質(zhì)組蛋白來(lái)減輕損傷程度，從而減少致死濃度鹽酸吸入引起的病死率。

2.4 Anti-H4中和抗體對(duì)酸吸入性ALI血?dú)獾挠绊?/p>

小鼠吸入致傷濃度鹽酸（0.1 mol/L， 2 mL/kg）后（常壓下FiO₂為21%），動(dòng)脈血氧分壓（PaO₂）明顯下降[38～61 mmHg，（52.6±8.7）mmHg]，達(dá)到ALI（PaO₂/FiO₂<300 mmHg）乃至ARDS（PaO₂/FiO₂<200 mmHg）標(biāo)準(zhǔn)（1 mmHg=0.133 kPa）。而給予anti-H4中和抗體預(yù)處理，可改善PaO₂，小劑量（2.5～5 mg/kg）效果較弱，大劑量（10～20 mg/kg）效果較明顯（P<0.05）;但是無(wú)中和作用的對(duì)照抗體IgG在小劑量和大劑量時(shí)均無(wú)保護(hù)作用（圖3）。小鼠吸入鹽酸后，動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO₂）升高不明顯，與小鼠呼吸頻率增快、加速CO₂排出有關(guān);動(dòng)脈血pH值降低至（7.23±0.11），與缺氧導(dǎo)致的代謝性酸中毒有關(guān)（具體數(shù)值未列出）。

2.5 Anti-H4中和抗體對(duì)酸吸入性ALI肺水腫的作用

小鼠吸入致傷濃度鹽酸（0.1 mol/L， 2 mL/kg）后，肺水腫明顯，表現(xiàn)為肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值顯著增加。給予anti-H4中和抗體預(yù)處理，可改善肺水腫程度，小劑量（2.5～5 mg/kg）效果不明顯，大劑量（10～20 mg/kg）效果明顯（P<0.05）;但是無(wú)中和作用的對(duì)照抗體IgG無(wú)保護(hù)作用（圖4）。

2.6 Anti-H4中和抗體對(duì)ALI肺組織中性粒細(xì)胞MPO活性的影響

小鼠吸入致傷濃度鹽酸（0.1 mol/L， 2 mL/kg）后，激活了機(jī)體炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞MPO活性顯著增加。而給予Anti-H4中和抗體預(yù)處理，可減輕炎癥反應(yīng)，小劑量（2.5 mg/kg）效果較差，5～10 mg/kg劑量已有較強(qiáng)的抗炎效果 （P<0.05），而大劑量（20 mg/kg）效果明顯（P<0.01）;無(wú)中和作用的對(duì)照抗體IgG無(wú)保護(hù)作用（圖5）。

2.7 Anti-H4中和抗體對(duì)酸吸入肺組織病理改變的影響

鹽酸吸入（0.1 mol/L， 2 mL/kg）后1 h，肺組織病理切片可見(jiàn)肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)， 肺泡間隔增寬， 點(diǎn)狀出血，肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹;在12～24 h最為嚴(yán)重，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，小片狀或灶狀出血，肺水腫明顯，肺泡內(nèi)大量纖維蛋白滲出。給予anti-H4中和抗體預(yù)處理，可改善病理表現(xiàn)，小劑量效果較弱，大劑量（10～20 mg/kg）效果較明顯;對(duì)照抗體IgG無(wú)保護(hù)作用（圖6）。

3 討論

化學(xué)毒物吸入是ALI的主要病因之一，可通過(guò)直接和間接效應(yīng)導(dǎo)致肺和全身臟器損傷。毒物吸入氣道造成的肺損傷可分為兩個(gè)時(shí)相，第一時(shí)相是毒物直接對(duì)肺泡上皮毛細(xì)血管膜的損傷，即時(shí)發(fā)生，損傷范圍有限;第二時(shí)相則是由第一時(shí)相損傷引起的廣泛且持續(xù)的炎性損傷，其核心即失控的炎癥反應(yīng)，涉及全身器官，而且存在正反饋加劇惡化，能產(chǎn)生多器官系統(tǒng)功能障礙乃至死亡等嚴(yán)重后果[16]。在第二時(shí)相損傷過(guò)程中，內(nèi)源性炎癥介質(zhì)無(wú)疑是損傷發(fā)生的關(guān)鍵，細(xì)胞外組蛋白即是其中重要的一員。

組蛋白是真核生物染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)蛋白，在進(jìn)化中高度保守。組蛋白主要包括5種類型： H1、H2A、H2B、H3 和H4，后4種組蛋白組成八聚體結(jié)構(gòu)，和外周環(huán)繞的雙螺旋DNA 片段結(jié)合成組蛋白-DNA 復(fù)合物，即核小體（nucleosome） 。

本文以鹽酸吸入引起的ALI模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究組蛋白在ALI發(fā)病過(guò)程中的變化規(guī)律以及與肺損傷程度的相關(guān)性，并且采用特異性抗組蛋白抗體進(jìn)行干預(yù)。研究結(jié)果顯示小鼠吸入鹽酸后1 h，血漿中組蛋白H4濃度明顯增加，在約12 h達(dá)到峰值，以后逐漸下降，72 h仍高于正常范圍。而且小鼠吸入鹽酸的濃度越高，血中組蛋白H4的濃度越高，二者具有明顯的正相關(guān)性。Anti-H4中和抗體可減少致死濃度鹽酸吸入的病死率，同時(shí)對(duì)血?dú)夥治觥⒎嗡[、炎癥細(xì)胞MPO活力、肺組織病理有明顯改善作用。小劑量（2.5～5 mg/kg）時(shí)中和抗體保護(hù)作用較弱，大劑量（10～20 mg/kg）效果較明顯。但是無(wú)中和作用的對(duì)照抗體IgG在小劑量和大劑量時(shí)均無(wú)保護(hù)作用。以上結(jié)果提示anti-H4中和抗體可通過(guò)拮抗組蛋白這種炎癥介質(zhì)來(lái)抑制失控的炎癥反應(yīng)，從而減輕組織、器官損傷程度，最終降低鹽酸吸入引起的病死率。

細(xì)胞外組蛋白在損傷中明顯升高，與致傷因素和損傷程度有良好的相關(guān)性;而且針對(duì)細(xì)胞外組蛋白給予干預(yù)，可減輕炎癥損傷。可見(jiàn)，細(xì)胞外組蛋白是一種重要的內(nèi)源性炎癥致傷介質(zhì)，在啟動(dòng)和加重炎癥性損傷反應(yīng)中起重要作用。細(xì)胞外組蛋白不僅可作為反映疾病嚴(yán)重程度的標(biāo)志物，還可作為抗體或藥物的分子標(biāo)靶用于臨床干預(yù)治療，為ALI/ARDS的防治提供了新的手段。

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（收稿日期：2014-09-30）

（本文編輯：鄭辛甜）

P247-252