謝光美　賈丹　葉華

摘要 [目的] 研究感染維氏氣單胞菌后齊口裂腹魚的組織病理變化。[方法] 用培養(yǎng)稀釋的維氏氣單胞菌菌液，經腹腔注射人工感染健康齊口裂腹魚，通過病理切片和HE染色技術觀察患病魚的腮、肝、腎、脾、腸、頭腎等器官的病理組織學變化。[結果] 染病魚的腮、肝、脾、腎、腸和頭腎均發(fā)生了明顯的病理變化，其病理特征主要表現(xiàn)為不同程度的出血，組織細胞變性、壞死，某些細胞的細胞核固縮、碎裂或崩解，病變嚴重的區(qū)域組織細胞壞死崩解成一片無結構的物質。[結論] 維氏氣單胞菌引起的病癥使齊口裂腹魚的免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)功能均減弱或喪失。

關鍵詞 齊口裂腹魚；維氏氣單胞菌；組織病理變化

中圖分類號 S941 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-117-05

Abstract [Objective] The research aimed to study the histopathological changes of Schizothorax prenanti infected with Aeromonas veronii. [Method] The healthy Schizothorax prenanti was artificially infected with diluted Aeromonas veronii by intraperitoneal injection. The hispathological changes of tissues （gill， liver， kidney， spleen， intestine and head kidney） of diseased S. prenanti were observed under microscope after hematoxylineosin staining. [Result] Aeromonas veronii infection caused obvious pathological changes in the gill， liver， spleen， kidney， intestine and head kidney of S. prenanti. The histopathological changes were characterized by hemorrhage at different degrees， vacuolar degeneration and necrosis. Some cells were changed by karyopyknosis， fragmentation or disintegration， and tissues disintegrated into an unstructured material in some regions damaged seriously. [Conclusion] The functions of the immune system， respiratory system and digestive system of S. prenanti infected with A. veronii were weakened or lost.

Key words Schizothorax prenanti； Aeromonas veronii； Histopathological changes

齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti），俗稱齊口細鱗魚、豹口、細甲魚、雅魚、洋魚等，隸屬鯉形目、鯉科、裂腹魚亞科、裂腹魚屬、裂腹魚亞屬，主要分布于長江上游、金沙江、岷江、大渡河、青衣江、酉水和漢江任河的上游、烏江下游等水系[1]。該魚肉質細嫩，味道鮮美，富含脂肪，為產區(qū)群眾喜愛雅魚佳肴，頗負盛名，是長江上游的重要經濟魚類。目前，齊口裂腹魚的人工養(yǎng)殖前景良好，養(yǎng)殖過程中已發(fā)現(xiàn)有多種細菌性疾病和寄生蟲感染[2-3] 。其中，細菌性疾病因其傳播速度快、死亡率高、治愈難度大等特點而受到廣大學者的關注。

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii），又稱凡隆氣單胞菌、維羅納氣單胞菌，1983年美國疾病預防與控制中心為紀念法國微生物學家Veron在弧菌和氣單胞菌研究中所作的貢獻而命名，作為近年來發(fā)現(xiàn)并鑒定的一個新種氣單胞菌，其研究才剛剛起步，但該菌普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中，其中一部分菌株是微生態(tài)環(huán)境中正常存在的，而另一些菌株具有致病性，主要感染變溫動物（如中華絨螯蟹、大鯢、羅非魚、斑點叉尾鮰等[4-7]），可引起大量死亡。筆者對齊口裂腹魚進行人工侵染維氏氣單胞菌，以引發(fā)齊口裂腹魚產生病癥，進而對齊口裂腹魚進行組織切片的顯微觀察，研究病魚各組織器官的病理變化，以期為該病的深入研究和臨床治療提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚。

試驗用齊口裂腹魚購自重慶城口任河水產養(yǎng)殖公司，暫養(yǎng)于西南大學榮昌校區(qū)實訓基地，選取15尾健康魚用于試驗，平均體長（18.2±0.3）cm，體重（86.4±1.5）g。用高錳酸浸泡魚缸1 h，再用清水洗凈，曝氣1 d。將選取的齊口裂腹魚放入缸中，進行試驗前暫養(yǎng)，7 d后進行注射感染。暫養(yǎng)期間均按照常規(guī)飼養(yǎng)管理進行，每天按魚體重的2%投喂餌料，并吸掉池底殘渣，每天換水約1/3。

1.1.2 菌株。

菌株由西南大學魚類繁育與健康養(yǎng)殖研究中心實驗室從患病黃顙魚體內分離到，于-80 ℃下保種。

1.2 方法

1.2.1 菌苗制備。① 用維氏氣單胞菌（保存于-80 ℃）在LBAMP平板上劃線并置于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h。②劃線的平板上已長出單個的菌落，挑取4個維氏氣單胞菌菌落于1.0 ml LBAMP液體培養(yǎng)基中（1.5 ml離心管）在28 ℃搖床搖菌至菌液混濁。

③取150 ml菌液涂布到無AMP的固體培養(yǎng)基平板并置于28 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)6 h。

④用生理鹽水洗脫收集菌液，取200 ml收集的菌液，用生理鹽水稀釋10倍后測定OD值，采用麥氏比濁法[8]測定并計算細菌濃度。⑤用無菌生理鹽水將菌液稀釋成1×107CFU/ml，備用。

1.2.2 人工感染試驗。

人工感染采用腹腔注射法，試驗組注射1×107CFU/ ml維氏氣單胞菌菌液，劑量0.2 ml/尾，每組5尾，并設置重復組1個，對照組注射生理鹽水0.2 ml/尾。對照組和試驗組分別飼養(yǎng)在不同的水箱中，試驗期間不投食，使用增氧機持續(xù)增氧。連續(xù)觀察其臨床癥狀和病理組織取樣。

1.2.3 魚發(fā)病情況觀察與取樣。

感染后觀察魚的發(fā)病癥狀及死亡情況，并將感染后的瀕死魚和對照組的健康魚分別取樣，取材部位包括鰓、肝臟、脾臟、腎臟、頭腎、腸道等組織。

1.2.4 病理組織切片的制備與觀察。

將所取的樣本放入Bouin氏液中固定24 h以上，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色后，用中性樹膠封片，在正置DPT2型OLMPUS顯微鏡拍攝系統(tǒng)下觀察并進行顯微拍照。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀和解剖病理變化

病魚體色變暗，體表粘液分泌明顯增多，于靠近水面處離群獨游。隨著病程的發(fā)展，病魚躁動不安，快速游動，最后病發(fā)死亡。感染試驗中齊口裂腹魚出現(xiàn)的臨床癥狀主要表現(xiàn)為：全身性充血，特別是頭部、頤部、鰓蓋、肛門、鰭條基部等處充血尤為嚴重，體表粘液增多。病魚腮絲腫脹，粘液增多，顏色變淡。眼球輕微突起， 全身鰭條輕微柱鰭，腹部膨大，腹壁變薄，沒有彈性，肛門充血紅腫，略微外凸（圖1A～F）。解剖后觀察發(fā)現(xiàn)，腹腔內有大量淡黃色或帶血的腹水，腎臟腫脹和輕微腸炎癥狀，腸管輕微臌氣、擴張，腸黏膜輕微充血、微紅，其他臟器無明顯變化。充血癥狀出現(xiàn)的順序為胸鰭鰭條基部首先出現(xiàn)紅腫充血，接著頭部、鰓蓋、頤部、肛門相繼出現(xiàn)充血癥狀。

2.2 病理組織學變化

從圖2可以看出，病魚肝臟、脾臟、腎臟、頭腎均出現(xiàn)細胞核固縮、破裂、溶解，細胞間空隙變大。①肝臟。健康齊口裂腹魚的肝臟組織細胞分布均勻，排列整齊（圖2A）。患病魚肝組織發(fā)生了彌散病變，出現(xiàn)大片自溶性壞死，肝細胞排列紊亂、稀疏。細胞腫脹，胞漿結構松散，著色不均，呈明顯的空泡變性（圖2B）。②脾臟。健康齊口裂腹魚的脾臟組織細胞排列緊密，輪廓清晰，細胞核核型規(guī)則，結構完整（圖2C）?；疾◆~脾臟織嚴重壞死，已看不清明顯的紅髓和白髓結構，細胞排列紊亂。嚴重病變時網(wǎng)狀細胞、造血組織和結構性結締組織大量壞死，崩解成一片粉紅色無結構物質，僅留下少量變性、壞死的造血組織和網(wǎng)狀細胞，形成壞死灶（圖2D）。

③腎臟。健康齊口裂腹魚腎臟細胞排列規(guī)則，腎小球和腎小管排列比較整齊有序，結構也比較清晰，腎間質充分填充于泌尿小管和腎內血管之間，分布均勻（圖2E）?；疾◆~腎臟結構出現(xiàn)崩解，腎小管排列紊亂，且大部分已變性壞死，腎小管上皮細胞脫離基底膜，胞漿呈紅色團塊狀流失于管腔，出現(xiàn)空泡變性。已看不見完整的腎小球結構，廣泛出血。腎臟間質組織結構模糊，大量間質細胞壞死，甚至消失（圖2F）。

④腸。健康齊口裂腹魚腸道組織粘膜皺襞多，柱狀上皮細胞排列緊密，肌層平整，腸絨毛完整，排列整齊，腸外膜完整（圖2G、I）。感染早期（人工感染13 h后），腸結構整齊，輪廓清晰，腸絨毛柱狀上皮細胞與結締組織輕微剝離，腸上皮、基底膜和粘膜下層有輕微出血，上皮杯狀細胞增多（圖2H）。病變后期（人工感染58 h后），腸上皮細胞壞死崩解，腸絨毛幾乎完全脫落、腸外膜結構破損，肌層平滑肌不完整，腸腔中有大量紅細胞（圖2J）。⑤鰓。健康齊口裂腹魚的鰓絲結構完整，鰓小片上皮細胞排列整齊，結構也比較清晰（圖2K）。染病魚的鰓小片變粗呈棒狀，鰓小片上皮細胞、毛細血管、結締組織和軟骨膜等軟組織都出現(xiàn)壞死崩解。鰓小片結構崩解，形成大量空泡（圖2L）。⑥頭腎。健康齊口裂腹魚頭腎細胞排列緊密，分布均勻而有規(guī)則，輪廓清晰，結構完整（圖2M）。染病魚的頭腎細胞排列紊亂，廣泛出血。頭腎細胞成片、網(wǎng)狀細胞、造血組織和結構性結締組織壞死、崩解，形成大空泡（圖2N）。

3 討論

筆者對齊口裂腹魚進行人工侵染維氏氣單胞菌，結果發(fā)現(xiàn)感染維氏氣單胞菌的齊口裂腹魚主要臨床表現(xiàn)為：全身性充血，各鰭鰭條基部、鰓蓋、頤部、肛門等處充血尤為嚴重，腹部膨大，解剖觀察可見腹部有腹水，腎臟腫脹和輕微腸炎癥狀；病理學觀察發(fā)現(xiàn)，染病魚的鰓、肝臟、脾臟、腎臟、頭腎和腸道等器官組織出現(xiàn)不同程度的充血、出血、腫大、變性、壞死以及炎癥細胞浸潤等病理變化。維氏氣單胞菌導致的齊口裂腹魚組織病理變化與其感染斑點叉尾鮰及嗜水氣單胞菌感染黃鱔（Monopterus albus）、香魚（Plecoglossus altivelis）、劍尾魚（Xiphophorus helleri）等多種魚類的組織病理學變化相似[9-13]。

維氏氣單胞菌侵入魚體后，可產生一系列的毒力因子[14]，對組織細胞造成損害，使其發(fā)生變性，引起機體防御反應，激發(fā)造血功能，使白細胞增多并從血管滲出，組織間炎性細胞浸潤。產生的氣溶素具有溶血性，其菌毛是重要的凝血因子，可促使細菌粘附在紅細胞表面，在血管內形成微血栓，廣泛的血管內凝血消耗了大量凝血因子和血栓細胞，使血液轉變?yōu)榈湍隣顟B(tài)，同時由于血管損傷，紅細胞滲出而產生出血現(xiàn)象，導致循環(huán)血流量減少。脾臟和腎臟是魚類的主要造血器官，二者出現(xiàn)病變引起造血功能障礙，加重貧血癥狀。貧血造成缺氧，鰓部本身的病變造成氣體交換障礙，加重了缺氧癥狀。缺氧導致全身各組織細胞物質代謝障礙，進而影響其結構和功能。停留在體表感染部位的病菌則在局部組織引起病變[14]，從而出現(xiàn)體表充血、出血、發(fā)炎和潰瘍等外觀癥狀。

腸道是營養(yǎng)物質的消化與吸收的場所，感染早期，腸上皮、基底膜和粘膜下層有輕微出血，上皮杯狀細胞增多，這些杯狀細胞的主要功能是分泌粘蛋白，這些蛋白覆蓋在粘膜表面不僅可以保護其不被細菌侵染，而且可以分泌溶菌酶起到殺菌作用[9]。病變后期，腸上皮細胞壞死崩解，腸絨毛幾乎完全脫落，腸道的結構和功能徹底喪失。

筆者對齊口裂腹魚的頭腎進行了組織切片的顯微觀察，研究了病魚頭腎的病理變化，這在以前的組織病理學研究報道中極為鮮見。頭腎是魚類重要的免疫、造血器官，除成體彈涂魚（Periophthalmus koelreueri）[15]等少數(shù)魚類的頭腎具有腎單位外，大多數(shù)硬骨魚類頭腎中無腎單位，其實質完全由網(wǎng)狀淋巴組織組成，頭腎中有動脈、靜脈和豐富的血竇[16]。該試驗中頭腎是維氏氣單胞菌攻擊的主要靶器官之一，患病魚頭腎出現(xiàn)明顯病變，部分淋巴組織結構變得不清晰，細胞壞死、崩解，細胞間隙變大，嚴重的區(qū)域完全解體而形成無細胞區(qū)，毛細血管壁破裂造成組織間紅細胞浸潤，血竇腔增大。染病魚頭腎病變導致機體特異性免疫功能下降，機體發(fā)生補償性病理變化，從而病魚頭腎中出現(xiàn)大量的淋巴細胞、漿細胞，發(fā)生炎癥反應。羅朝暉等[17]研究汞、鉻離子對黃鱔頭腎組織結構的影響也發(fā)現(xiàn)當重金屬污染物毒性低、濃度較低、污染時間較短時，頭腎組織中的淋巴細胞、粒細胞和黑色素巨噬細胞數(shù)量均顯著增多，隨著重金屬離子濃度的增加和染毒時間的延長，淋巴組織逐漸松散，排列稀疏混亂，淋巴細胞界限逐漸不清晰，呈退化趨勢，數(shù)量減少，紅血細胞大量破壞，血竇擴張。由此可見，頭腎是魚類重要的免疫器官，當細菌和重金屬等有害物質浸入時會發(fā)生相應的免疫機能，但有害物質會使其結構遭到破壞，導致其免疫功能下降甚至喪失。

4 小結

該驗結果表明染病魚的鰓、肝臟、脾臟、腎臟、頭腎和腸道均發(fā)生了明顯的病理變化，主要表現(xiàn)為不同程度的出血，組織細胞變性、壞死，某些細胞的細胞核固縮、碎裂或崩解，病變嚴重的區(qū)域組織細胞壞死崩解成一片無結構的物質，說明維氏氣單胞菌引起的病癥不僅使齊口裂腹魚的免疫系統(tǒng)遭到破壞，也使其呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的功能減弱或喪失。病魚由于缺血、缺氧以及血液循環(huán)、呼吸、消化和排泄等機能不能正常進行，最終導致魚體衰竭而死亡。這與鯉魚（Cyprims carpis）、團頭魴（Megalobrama ambiycephala Yih）、歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）細菌性敗血癥發(fā)病過程相似[18-19]。

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