鳳鳴 朱明星 肖新 宇蔡斌

摘要：通過對豬痢疾短螺旋體的檢測以及感染情況調(diào)查，從而進行免疫原性分析。對興化市及其周邊地區(qū)50個豬養(yǎng)殖場中發(fā)生豬痢疾的感染情況進行調(diào)查，并對豬痢疾的端螺旋體實施檢測，進而培養(yǎng)并進行免疫原性分析。在調(diào)查的50個豬養(yǎng)殖場中發(fā)生感染的病豬占到了6.3%，通過免疫原性初步分析，可以通過免疫重組引起抗體的有效性提高。豬痢疾短螺旋體的檢測、感染情況調(diào)查及免疫原性初步分析可以為豬痢疾的疫苗制作提供一個理論基礎。

關鍵詞：豬痢疾；短螺旋體的檢測；感染情況調(diào)查；免疫原性初步分析

豬痢疾在臨床上又叫做血痢[1]，是一種感染生長育肥期豬的腸道傳染病，而豬痢疾短螺旋體是一種細菌性病原，該病原體會引起豬的大量死亡，從而給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失，豬在感染短螺旋體病原體后在臨床上主要表現(xiàn)為消瘦、脫水、糞便變紅。近年來隨著抗生素藥物的使用，豬痢疾短螺旋體病原體逐漸的已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性，一些常規(guī)的抗生素已經(jīng)逐漸的失去了作用，因此，加強豬痢疾短螺旋體的檢測以及免疫原性分析顯得至關重要?，F(xiàn)主要對豬痢疾短螺旋體的檢測、感染情況調(diào)查及免疫原性初步分析等相關資料予以回顧分析，就其中的主要內(nèi)容報道如下。

1材料及方法

1.1材料

對興化市及其周邊地區(qū)50個豬養(yǎng)殖場中發(fā)生豬痢疾的感染情況進行調(diào)查，并從興化市動物疫病預防控制中心收集了腹瀉樣品38份、腸道樣本60份，此外還從興化市的養(yǎng)殖場采取了腸道樣品280份。主要來源是母豬以及不同齡期的育肥豬的糞便，且這些樣本采集對象均不同程度的表現(xiàn)出腹瀉，此外還需要準備相關的試劑，主要有血液及DNA提取試劑盒以及糞便DNA提取試劑盒，另外還有厭氧袋、壯觀霉素、革蘭氏染色液等。需要用到的儀器包括高速冷凍離心機、生物安全柜、掃描電子顯微鏡、恒溫水浴鍋以及實時熒光定量PCR儀器。在免疫原性分析中需要用到的有PCR酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶。

1.2方法

豬痢疾短螺旋體感染情況調(diào)查主要采用實地調(diào)查的方法，對不同養(yǎng)殖場豬痢疾情況進行統(tǒng)計分析。

對于豬痢疾短螺旋體的檢測主要有以下幾個步驟[2]：①糞便DNA的提取，取180mg左右的豬痢疾糞便，放置到2mL的離心管中，此后將該離心管放到冰上面，加入1.4mL的ASLbutter到每一個管中，搖勻之后放置在70℃條件下，時間為5min，此后進行振蕩并離心，去除1個新的離心管吸取離心之后的懸浮液1.2mL，并向其中加入抑制劑，再次振蕩，直到抑制片完全吸收，之后再次離心操作，離心結束后取出1.5mL的離心管放入上層懸浮液，再次離心，在離心過程中加入一些外加劑，直到提取出糞便內(nèi)的病原體DNA；②腸黏膜組織的DNA提取，首先刮取25mg的腸黏膜放入1.5mL的離心管中，同時加入180μLATL的緩沖液，然后加入20μL蛋白酶K，在混合之后，保持56℃條件下對其孵育，在孵育過程中定期的搖動離心管，此后取出離心管渦旋15秒，加入200μL緩沖液搖勻，再加入200μL的無水乙醇，渦旋充分混合。提取裂解液加入到2mL的吸附柱中，離心之后放入一個新的收集管，此后再經(jīng)過洗脫液最終，提取出腸黏膜組織的DNA；③陽性樣本的分離培養(yǎng)[3]，在上面的檢測中將檢測出來的陽性樣本需要及時進行分離培養(yǎng)，接種之后，在培養(yǎng)基上分別加入壯觀霉素、多黏菌素以及萬古霉素，根據(jù)該病原體的生活條件，需要在厭氧條件下保持在37℃，培養(yǎng)時間為5天左右，在培養(yǎng)完成后，使用顯微鏡對豬痢疾端螺旋體實施檢測，并進行革蘭氏染色，染色的步驟分別為龍膽紫、碘液、脫色液、沙黃，每一個步驟持續(xù)時間為10秒，掃描電子顯微鏡。

2結果

2.1熒光定量PCR檢測分析

對378份樣本DNA進行熒光定量PCR檢測，在檢測結果中通過分析發(fā)現(xiàn)有35份陽性樣本，在檢出的陽性樣本中，在臨床表現(xiàn)腹瀉的病豬感染率較大，而從動物防疫疾病預防和控制中心搜集的無腹瀉樣本中感染率比較低，此外在不同地區(qū)的病豬感染方面，沒有表現(xiàn)出明顯的差異。

2.2基因BlpA生物信息分析

根據(jù)BlpA的基因序列，使用DNAStar軟件找出其中的ORF，經(jīng)過分析，大小是816bp，由271個氨基酸組成，理論上分子量為29652.55Da，等電位是4.47，屬于外源蛋白。將豬痢疾短螺旋體的DNA作為模版，在PCR電泳過程中出現(xiàn)了一目亮帶，主要在816bp附近，這個和我們預期的設想是一致的。

3討論

豬痢疾是一種傳染性比較強的疾病，在育肥期的豬中比較常見[4]，同時發(fā)病率比較高，在對興化市的50個養(yǎng)豬場開展調(diào)查之后，感染的病豬占到了6.3%，并且出現(xiàn)了部分病豬死亡的事件，所以豬痢疾屬于養(yǎng)豬過程中一個重要的醫(yī)學難題，并且會引起一系列的不良反應，首先豬的正常生長受到了限制，生長比較慢，提高了飼養(yǎng)過程中的成本，養(yǎng)豬場需要花費更多的人力和物力去管理病豬，同時豬痢疾具有傳染性，會嚴重影響到其他健康豬的生長，可能會引起較多豬的感染，嚴重的引發(fā)病豬死亡，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失，豬痢疾需要及時的診斷和治療，才能盡可能的降低由此造成的經(jīng)濟損失。

在豬痢疾端螺旋體檢測過程中對378份樣本DNA進行熒光定量PCR檢測，在檢測結果中通過分析發(fā)現(xiàn)有35份陽性樣本，而且280份樣品是從腹瀉的病豬采集的，其余的98是來自興化市的動物疾病預防和控制中心，這些是沒有腹瀉的，在沒有腹瀉的檢測中陽性樣本3份，其余的32份均是來自腹瀉的病豬，而且不同地區(qū)的豬痢疾發(fā)病率是有差異的，但是差異不明顯。不同齡期的豬在豬痢疾發(fā)病方面也是有差異的，將前幾年豬痢疾發(fā)病率的調(diào)查的豬痢疾病情發(fā)展比較，發(fā)現(xiàn)豬痢疾病情發(fā)展出現(xiàn)了下降趨勢，這和學者的研究工作是分不開的。

豬痢疾屬于一種常見病，可以預防治療，具體的就是要做好每個環(huán)節(jié)的監(jiān)測工作，并注意養(yǎng)豬場的環(huán)境問題，特別是在夏季時，一定要定期的進行殺菌消毒。

通過對豬痢疾短螺旋體免疫原性初步分析[5]，發(fā)現(xiàn)豬痢疾短螺旋體在長期的治療過程中主要是依靠一些抗生素藥物進行治療，缺乏疫苗、各種抗生素的使用導致豬痢疾短螺旋體發(fā)生變異，逐漸的產(chǎn)生了抗藥性。在后期的治療過程中普通的一些抗生素藥物已經(jīng)失去了作用，及時有效地研制出豬痢疾短螺旋體的疫苗顯得至關重要。

當前階段，對于豬痢疾短螺旋體的疫苗研究主要還在毒力蛋白上，使用克隆的方法可以實現(xiàn)亞單位疫苗的制作，而且在制作過程中，需要的時間短，可以大規(guī)模的生產(chǎn)，并且制作成本低，值得臨床上研究和制作。

豬痢疾短螺旋體的編碼基因Blpa進行了擴增，并重新構建了重組質(zhì)粒，構建成功后表達出了重組蛋白，并提取了相關樣品，提取出來的樣品對小鼠實施免疫，在免疫過程中監(jiān)測血清中特異性抗體的含量變化，在第一次免疫結束后，根據(jù)檢測結果，小鼠體內(nèi)的血清特異性抗體有一個較高的水平，而且在一段時間內(nèi)沒有發(fā)生改變，通過這個實驗證明了使用重組蛋白可以誘發(fā)高水平抗體的產(chǎn)生，有利于提高豬的免疫力，也為豬痢疾短螺旋體疫苗的研制工作提供了一個科學依據(jù)。

大規(guī)模的養(yǎng)豬場得到了快速發(fā)展，但是豬痢疾短螺旋體會嚴重影響到豬的正常生長以及養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟利益，所以做好豬痢疾短螺旋體感染的調(diào)查工作很重要，在此基礎上進行免疫原性初步分析，進一步的掌握短螺旋體的免疫反應，從而確定最佳的藥品做好預防和治療工作。此外，豬的其他一些疾病有可能會被誤診為豬痢疾短螺旋體，需要明確豬痢疾短螺旋體的診斷標準，比如在檢測過程中使用的熒光PCR檢測技術，就具有重要的診斷價值。

總之，豬痢疾短螺旋體的檢測具有重要意義，做好豬痢疾短螺旋體的預防和治療工作需要選擇合適的抗生素藥物，同時還需要積極地研制疫苗，從而做好疫苗接種，避免豬痢疾短螺旋體感染的發(fā)生。

參考文獻：

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[3] 王海軍，芮藝，汪鵬旭.豬痢疾短螺旋體與附紅細胞體混合感染的防治[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2010（10）：25-26.

[4] 吳德才，曲桂林，單立有.豬痢疾的診斷與防治[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2006（04）：73-74.

[5] 李常德.豬痢疾密螺旋體病的防治[J].當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2009（06）：17.