朱鑫　易潭　陳琳　等

摘要為了解翹嘴鱖胚胎發(fā)育中miR146a的表達規(guī)律以及溫度對miR146a表達的影響，將翹嘴鱖受精卵分別在22 ℃和25 ℃水溫下孵化，并利用實時熒光定量方法檢測miR146a在各個發(fā)育階段的表達.結(jié)果顯示，在22 ℃孵化時，miR146a的表達在原腸期前處于較高水平且各時期表達沒有顯著性差異（P>0.05），在尾芽期后出現(xiàn)顯著性降低（P<0.05），并在出膜時達到最低值；在25 ℃孵化時，miR146a的表達直到神經(jīng)胚期仍處于較高水平且各時期表達沒有顯著性差異（P>0.05），發(fā)育進入尾芽期后表達顯著降低（P<0.05），在肌效期達到最低值；miR146a在25 ℃水溫孵化時的表達較22 ℃孵化同時期的表達都出現(xiàn)顯著降低（P<0.05）.研究表明，miR146a可能主要在胚胎發(fā)育后期起到調(diào)控胚胎發(fā)育的作用，在尾芽期后通過下調(diào)表達來促進胚胎的發(fā)育；并且溫度能影響miR146a的表達，溫度升高會降低miR146a在胚胎發(fā)育各個時期的表達，將有利于胚胎的發(fā)育.

關(guān)鍵詞翹嘴鱖；miR146a；發(fā)育性表達；胚胎發(fā)育；溫度調(diào)節(jié)

中圖分類號Q752； S917.4文獻標識碼A文章編號10002537（2015）05002106

Expression Analysis of Siniperca Chuatsi MiR146a During Embryonic

Development and Effect of Temperature on MiR146a Expression

ZHU Xin 1，2#， YI Tan 1，2#， CHEN Lin1， WU Ping1， WANG Jianhua1，

CHEN Tao2， ZHANG Jianshe 1， CHU Wuying 1*

（1.Department of Biological and Environmental Engineering， Changsha University， Changsha 410003， China；

2. College of Veterinary Medicine， Hunan Agriculture University， Changsha 410128， China）

AbstractTo investigate the expression pattern of miR146a in embryonic developmental stage and the effect of temperature on the expression of miR146a in Siniperca chuatsi， the embryos were incubated under different temperatures and the expression of miR146a during embryonic developmental stage was detected by RTqPCR. The results showed that the expressions of miR146a were at a higher level and there is no significant difference before gastrula stage when the embryos incubated under 22 ℃ （P>0.05）. And then the expressions of miR146a decreased after tailbud stage and decreased to the lowest level at larval stage （P<0.05）. When the embryos incubated under 25 ℃， the expressions of miR146a were at a higher level and there is no significant difference till neurula stage （P>0.05）. Once at tailbud stage， the expression of miR146a significantly decreased （P<0.05） and to the lowest level at muscular effect stage. It was interesting that the expressions of miR146a were significantly decreased at each developmental stage incubated under 25 ℃ when compared with 22 ℃ incubation （P<0.05）. The results indicated that miR146a mainly involved in regulating embryonic development during later embryonic developmental stages and promoted embryonic development by down regulation its expression. In addition， the expressions of miR146a could decrease when the incubation temperature increased， and miR146a might involve in the effect of temperature on embryonic development of Siniperca chuatsi.

Key wordsSiniperca chuatsi； miR146a； developmental expression； embryonic development； temperature regulation

上世紀80年代，隨著鱖魚人工繁殖獲得成功，我國開始大規(guī)模推廣鱖魚養(yǎng)殖，使之成為我國主要名貴養(yǎng)殖魚類之一.翹嘴鱖因其肉質(zhì)細嫩而鮮美，無小刺，且富含蛋白質(zhì)，現(xiàn)已成為水產(chǎn)品市場的緊俏商品和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要品種[1].深入探索翹嘴鱖的發(fā)育機制能夠為魚類發(fā)育生物學研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖提供一些有價值的參考資料.

microRNA（miRNA） 是真核生物中一類進化上保守的參與調(diào)控基因表達的非編碼小分子RNA.它通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)互補配對來促進靶mRNA 降解或翻譯抑制，在基因表達中起著負調(diào)控作用[23].miRNA在胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生和新成代謝等一系列生物過程中發(fā)揮重要的作用[45]，但是有關(guān)miRNA在胚胎的表達特性及其在魚類早期發(fā)育中的功能研究還很少.早期的研究表明miRNA對胚胎發(fā)育起到重要作用.鼠和人的胚胎干細胞在發(fā)育形成胚胎小體時，胚胎干細胞中一些特定的miRNA的表達會下調(diào)[67]，缺失miRNA的鼠和斑馬魚胚胎在原腸胚形成、神經(jīng)發(fā)育、體節(jié)形成時出現(xiàn)發(fā)育畸形甚至停滯[89].Kuang等[10]發(fā)現(xiàn)miR146a能夠與Numb基因的3′端非翻譯區(qū)互補配對，并且驗證了miR146a能夠抑制Numb的表達，而Numb調(diào)控的靶基因Notch參與一系列胚胎發(fā)育和形態(tài)形成過程，如成肌細胞的增殖、神經(jīng)發(fā)育和體節(jié)形成[11]，因此可以推斷miR146a很可能參與調(diào)控胚胎的發(fā)育.

水溫可以改變胚胎發(fā)育所需時間，較高的孵化溫度能加速魚類胚胎的發(fā)育速率，縮短孵化所需的時間[12].何利君[13]的研究顯示，翹嘴鱖胚胎發(fā)育在21，25和27 ℃下，分別經(jīng)過74.05，56.73和48.37 h孵育后出膜.在適宜溫度范圍內(nèi)，適當升溫可以加快胚胎發(fā)育的進程，但miRNA是否參與到水溫影響翹嘴鱖胚胎發(fā)育的分子機制中尚不明確.在本研究中，我們分別在22和25℃水溫下孵化翹嘴鱖的受精卵，并利用實時熒光定量的方法檢測miR146a在幾個重要發(fā)育階段的表達，以此了解miR146a在胚胎發(fā)育進程中的表達模式及水溫對miR146a表達的影響.

1材料與方法

1.1實驗魚

實驗用親魚為湖南省水產(chǎn)科學研究所無病無傷、體格健壯、性腺成熟度好的翹嘴鱖，雌性個體為體質(zhì)量1.0 kg以上的2～4齡魚，雄性個體為體質(zhì)量0.75 kg以上的2～4齡魚.

湖南師范大學自然科學學報第38卷第5期朱鑫等：翹嘴鱖miR146a在胚胎發(fā)育過程中的表達及溫度對其表達的影響1.2方法

1.2.1不同溫度下胚胎的孵化和取樣使用寧波市激素制品有限公司生產(chǎn)的絨毛膜促性腺激素（HCG）、促黃體生成素釋放激素類似物和鯉鯽魚腦垂體（PG）對親魚進行人工催產(chǎn)，操作方法參考劉希良[14]等文獻報導.將受精卵置于直徑15 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放200～300顆，分別在22 ℃和25 ℃的水溫中孵化.期間，每半小時更換一次曝氣水以保證溶氧充足.自受精后定時將翹嘴鱖魚卵置于顯微鏡下觀察翹嘴鱖胚胎的發(fā)育進程，當所有魚卵半數(shù)以上達到某個時期時確定為到達該時期.當受精卵進入二細胞、囊胚、原腸、神經(jīng)、尾芽、肌效、心搏、出膜期時，分別取適量受精卵置于裝有Trizol的2 mL離心管中，每個時期取5管平行樣，置于-20 ℃冰箱保存.

1.2.2總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成保存于Trizol中的受精卵用破口槍頭吸打數(shù)次，直至胚胎全部破碎，然后置于裝有1 mL Trizol的離心管中.總RNA提取流程參照 Trizol Reagent（Invitrogen）說明書操作.所有總RNA樣品分別取1 μL作為模板，按照One Step PrimeScript miRNA cDNA synthesis Kit試劑盒（寶生物公司，大連）的說明進行逆轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA第一鏈，于4 ℃冰箱保存待用.

1.2.3實時熒光定量檢測miR146a的表達根據(jù)Chu等[15]建立的鱖魚miRNA文庫，設(shè)計miR146a特異性的上游引物，以管家基因βactin作為胚胎發(fā)育階段樣品的內(nèi)參基因[16].用Primer 5.0軟件設(shè)計熒光定量PCR的引物，引物由上海鉑尚生物公司合成 （見表1）.取2 μL逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板，加入12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （寶生物公司， 大連），1 μL特異性的上游引物和1 μL通用下游引物（UnimiR qPCR Primer， 10 μmol/L， 寶生物公司）， 8.5 μL的無菌水，總體積25 μL，擴增反應(yīng)在BioRad CFX96 system （USA）上進行.擴增條件為：（1）95 ℃預變性60 s；（2）擴增和定量，95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸25 s，重復40個循環(huán).（3） 繪制融解曲線（65～95 ℃，每0.1 ℃檢測一次熒光值）.

表1熒光定量檢測用引物

Tab.1Primers used for miRNA detection

名稱Name引物序列（5′→3′）miR146aFCGTGAGACTGATTCCATAGATGGβactinFGCCGTGACCTGACTGACTACCTβactinRCGCAAGACTCCATACCCAAGAAG注：miR146a定量所使用的下游引物為通用引物，序列未公布，購自寶生物工程（大連）有限公司（濃度：10 μmol/L）.

1.2.4數(shù)據(jù)處理相對表達結(jié)果計算公式為R=2-ΔΔCt，其中Ct值為PCR反應(yīng)循環(huán)閾值，ΔΔCt的計算公式為：ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組.采用SPSS12.0軟件對所得相對表達豐度數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（Oneway ANOVA），并采用最小顯著差數(shù)法（LSD）進行多重比較（P<0.05表示顯著性差異，P<0.01表示差異極顯著），結(jié)果以平均值±標準誤差（Mean±SE，n=5）表示.

2結(jié)果與分析

2.1miR146a在胚胎發(fā)育性表達

有文獻報道m(xù)iRNA在不同的細胞和不同的發(fā)育階段有差異性的表達，并且它們參與細胞的生長、分化以及凋亡等過程[1718].目前miRNA在魚類胚胎發(fā)育階段的表達研究還較少，且暫未有文獻報道m(xù)iR146a在魚類胚胎的發(fā)育性表達.圖1結(jié)果顯示，胚胎在22 ℃水溫孵化下，miR146a的表達在發(fā)育早期處于較高水平，其中原腸期前的各時期表達沒有顯著性差異，進入尾芽期后顯著性地降低，并持續(xù)降低，在出膜期時達到最低水平.而在25 ℃孵化時，miR146a的表達在神經(jīng)期前處于較高水平且各時期都沒有顯著性差異，在尾芽期顯著性地降低，在肌效期達到最低值，心搏期和出膜期處于較低水平并且之間沒有顯著性差異（圖1）.

圖1miR146a在翹嘴鱖受精卵不同發(fā)育時期的相對表達情況.A和B分別為miR146a在22 ℃和25 ℃水溫孵化下不同時期的發(fā)育性表達.相對表達值為平均值±標準誤差（n=5）.不同的字母代表存在顯著性差異（P<0.05）

Fig.1Detection of miR146a expression at different embryonic developmental stages. A， B represent miR146a expressed at different embryonic developmental stages when incubation under 22 ℃and 25 ℃ water temperature， respectively. Values are the mean ±SE， n=5. The different letters indicate significant differences between columns （P<0.05）2.2miR146a在不同溫度孵化下的差異性表達

圖1的結(jié)果顯示溫度影響了miRNA在胚胎發(fā)育中的表達.當比較胚胎發(fā)育同一時期在22 ℃和25 ℃水溫孵化下miR146a的表達時發(fā)現(xiàn)，miR146a在25 ℃水溫孵化時的表達較22 ℃孵化下同時期的表達都出現(xiàn)顯著性地降低，其中除出膜期外，其他時期的表達差異極顯著（P<0.01）（圖2）.

圖2miR146a在翹嘴鱖受精卵不同水溫孵化下，同一時期的差異性表達.每個時期均以22 ℃孵化下的表達值作為對照，*代表顯著性差異（P<0.05），**代表差異極顯著（P<0.01）

Fig.2The contrastive expression of miR146a incubated under different water temperature. The data was expressed as the relative change compared with the expression level of each stage incubated under 22 ℃， asterisk （*） indicates significant difference （P<0.05）， double asterisk （**） indicates significance at P<0.013討論

miR146a最初被發(fā)現(xiàn)在miRNA中參與天然免疫應(yīng)答，當單核細胞受到細菌內(nèi)毒素侵襲時，miR146a的表達顯著上調(diào)[19].近年來許多文獻報道，miR146a調(diào)節(jié)的許多靶基因參與了細胞分化的作用，但這些研究主要集中在分析miR146a對造血細胞的分化作用，而miR146a對胚胎發(fā)育的作用暫未見到相關(guān)報道.Kuang等[10]的研究驗證了miR146a能夠抑制Numb的表達.Numb是一種進化保守蛋白，其作為內(nèi)源性細胞命運決定因子，對細胞分裂的命運起決定作用.Numb對胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育作用也已經(jīng)被證明[2021].Numb作為一個重要的細胞命運決定蛋白，參與Notch的負性調(diào)控，兩者的平衡決定了細胞分化的方向[22].Notch信號轉(zhuǎn)導通路作為生物發(fā)育分化中高度保守的通路，通過與配體的相互作用產(chǎn)生級聯(lián)瀑布效應(yīng)，參與細胞發(fā)育過程中分化方向的選擇，并對細胞的增殖及凋亡也起著重要的作用[2324].Notch信號通路在胚胎發(fā)育中起到調(diào)節(jié)細胞增殖和決定細胞命運的作用[25].激活Notch信號能夠促進肌原細胞的增殖，并降低MyoD和myogenin的表達來延遲成肌細胞的分化[26].miR146a及其靶基因的研究為進一步了解miR146a在胚胎發(fā)育中潛在的作用提供了一些重要的理論依據(jù).

翹嘴鱖miR146a胚胎發(fā)育性表達結(jié)果顯示，在22 ℃和25 ℃水溫孵化下，miR146a表達規(guī)律趨勢總體相似，但在不同溫度下，miR146a的表達在幾個時期經(jīng)歷了微調(diào)，說明溫度確實影響了miR146a的表達.本文結(jié)果顯示在胚胎發(fā)育早期（二細胞到神經(jīng)胚期）miR146a的表達趨于穩(wěn)定且處于較高水平（除22 ℃神經(jīng)胚期有顯著性上升），在進入尾芽期后表達都顯著性地降低.Giraldez等[27]的研究表明miRNA的作用并不是在發(fā)育早期決定細胞的命運而是影響發(fā)育后期組織的發(fā)育和形成，而在神經(jīng)胚期前胚胎的大部分組織器官還未開始分化，本文結(jié)果與Giraldez等的結(jié)論相符.胚胎發(fā)育經(jīng)過神經(jīng)胚期后，是器官形成的主要階段，而本文結(jié)果顯示miR146a的表達在尾芽期顯著降低，表明miR146a的靶基因在這個階段后受到其抑制作用將明顯降低，并推測miR146a的靶基因的作用可能是促進胚胎發(fā)育的.Kuang等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Numb是miR146a的靶基因，Numb能夠促進胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育[2021]，Numb參與調(diào)節(jié)的Notch信號通路也對胚胎的發(fā)育起到重要的作用.

溫度是影響魚類胚胎發(fā)育的一個主要的外在因子.大量研究表明，在適宜溫度下，隨著水溫的升高，胚胎的發(fā)育進程加快，孵化所需時間縮短[2829]，但是miRNA的表達是否受到溫度的影響還未見相關(guān)報道.從圖2可以看出，在25 ℃孵化時，miR146a在不同階段的表達都比22 ℃時出現(xiàn)顯著性降低.這一結(jié)果表明溫度升高能降低miR146a的表達，從而調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)育.有研究表明肌纖維增生和增粗的速率在較高的水溫孵化時都會升高，但是溫度對肌纖維的增粗效果強于增生[5].在25 ℃孵化時，miR146a的表達顯著性降低能增強Numb對Notch信號通路的抑制作用，促進成肌細胞的分化，從而有利于胚胎中肌肉組織形成.這一結(jié)果表明了miR146a在參與水溫調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育的過程中是通過下調(diào)來促進發(fā)育的.

4結(jié)論

研究表明，miR146a在胚胎發(fā)育早期（神經(jīng)期前）的作用不明顯.在胚胎發(fā)育后期（尾芽期至出膜），miR146a通過下調(diào)其表達來促進胚胎的發(fā)育.而水溫升高能顯著降低miR146a在胚胎發(fā)育每個時期的表達，減少其對靶基因Numb的抑制，發(fā)揮促進細胞分化的作用，從而有利于胚胎發(fā)育的進程.

參考文獻：

[1]李玉瓏，農(nóng)小獻，李虹輝，等. 鱖魚生肌調(diào)節(jié)因子 MyoD 的克隆及其發(fā)育表達分析[J].湖南師范大學自然科學學報， 2013，36（4）：6368.

[2]LIU J. Control of protein synthesis and mRNA degradation by microRNAs[J]. Curr Opin Cell Biol， 2008，20（2）：214221.

[3]XIE X， LU J， KULBOKAS E J， et al. Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3′UTRs by comparison of several mammals[J]. Nature， 2005，434（7031）：338345.

[4]FU Y， SHI Z， WU M， et al. Identification and differential expression of microRNAs during metamorphosis of the Japanese flounder （Paralichthys olivaceus）[J]. PLoS One， 2011，6（7）：e22957.

[5]SONG L， TUAN R S. MicroRNAs and cell differentiation in mammalian development[J]. Birth Defects Res C Embryo Today， 2006，78（2）：140149.

[6]HOUBAVIY H B， MURRAY M F， SHARP P A. Embryonic stem cellspecific microRNAs[J]. Dev Cell， 2003，5（2）：351358.

[7]SUH M R， LEE Y， KIM J Y， et al. Human embryonic stem cells express a unique set of microRNAs[J]. Dev Biol， 2004，270（2）：488498.

[8]BERNSTEIN E， KIM S Y， CARMELL M A， et al. Dicer is essential for mouse development[J]. Nat Genet， 2003，35（3）：215217.

[9]GIRALDEZ A J， CINALLI R M， GLASNER M E， et al. MicroRNAs regulate brain morphogenesis in zebrafish[J]. Science， 2005，308（5723）：833838.

[10]KUANG W， TAN J， DUAN Y， et al. Cyclic stretch induced miR146a upregulation delays C2C12 myogenic differentiation through inhibition of Numb[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2009，378（2）：259263.

[11]CONBOY I M， RANDO T A. The regulation of Notch signaling controls satellite cell activation and cell fate determination in postnatal myogenesis[J]. Dev Cell， 2002，3（3）：397409.

[12]KINNE O， KINNE E M. Rates of development in embryos of a cyprinodont fish exposed to different temperaturesalinityoxygen combinations[J]. Can J Zool， 1962，40（2）：231253.

[13]何利君. 溫度對鱖魚胚胎發(fā)育的影響[J]. 四川畜牧獸醫(yī)學院學報， 1999，13（4）：1922.

[14]劉希良，賓石玉，王開卓，等. 翹嘴鱖的人工繁殖與胚胎發(fā)育觀察[J].廣西師范大學學報：自然科學版， 2013，31（2）：100106.

[15]CHU W Y， LIU L S， LI Y L， et al. Systematic identification and differential expression profiling of microRNAs from white and red muscles of Siniperca chuatsi[J]. Curr Mol Med， 2013，13（8）：13971407.

[16]ZHOU R X， MENG T， MENG H B， et al. Selection of reference genes in transcription analysis of gene expression of the Mandarin fish， Siniperca chuasti[J]. Zool Res， 2010，31（2）：141146.

[17]NEILSON J R， ZHENG G X， BURGE C B， et al. Dynamic regulation of miRNA expression in ordered stages of cellular development[J]. Genes Dev， 2007，21（5）：578589.

[18]MCCARTHYJ J， ESSER K A. MicroRNA1 and microRNA133a expression are decreased during skeletal muscle hypertrophy[J]. J Appl Physiol， 2007，102（1）：306313.

[19]TAGANOV K D， BOLDIN M P， CHANG K J， et al. NFkappaBdependent induction of microRNA miR146， an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006， 103（33）：1248112486.

[20]PETERSEN P H， ZOU K， HWANG J K， et al. Progenitor cell maintenance requires numb and numblike during mouse neurogenesis[J]. Nature， 2002，419（6910）：929934.

[21]CONBOY I M， RANDO T A. The regulation of Notch signaling controls satellite cell activation and cell fate determination in postnatal myogenesis[J]. Dev Cell， 2002，3（3）：397409.

[22]LIU X H， YAO S， QIAO R F， et al. Nandrolone reduces activation of Notch signaling in denervated muscle associated with increased Numb CXpression[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2011，414（1）：165169.

[23]LEONG K G， KARSAN A. Recent insishts into the role of Notch signaling in tumorigenesis[J]. Blood， 2006，107（6）：22232233.

[24]NICOLAS M， WOLFER A， RAJ K， et al. Notchl functions as atumor suppressor in mouse skin[J]. Nat genet， 2003，33（3）：416421.

[25]ARTAVANISTSAKONAS S， RAND M D， LAKE R J. Notch signaling： cell fate control and signal integration in development[J]. Science， 1999，284（5415）：770776.

[26]NOFZIGER D， MIYAMOTO A， LYONS K M， et al. Notch signaling imposes two distinct blocks in the differentiation of C2C12 myoblasts[J]. Development， 1999，126（8）：16891702.

[27]GIRALDEZ A J， CINALLI R M， GLASNER M E， et al. MicroRNAs regulate brain morphogenesis in zebrafish[J]. Science， 2005，308（5723）：833838.

[28]胡振禧，黃洪貴，吳妹英，等. 溫度對斑鱖胚胎發(fā)育的影響[J]. 淡水漁業(yè)， 2014，44（3）：104107.

[29]陳昆慈，朱新平，杜合軍，等. 溫度和鹽度對寶石鱸胚胎發(fā)育的影響[J].中國水產(chǎn)科學， 2007，14（6）：10321037.

（編輯王?。?