李利超　孫化雨　婁永峰　趙韓生　高志民

（國際竹藤中心　國家林業(yè)局竹藤科學與技術(shù)重點實驗室　北京　100102）

毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因結(jié)構(gòu)及表達模式分析

李利超孫化雨婁永峰趙韓生高志民

（國際竹藤中心國家林業(yè)局竹藤科學與技術(shù)重點實驗室北京100102）

植物通過光合作用將光能轉(zhuǎn)換為化學能，捕光色素結(jié)合（LHC）蛋白與色素形成的復合體在捕獲、傳遞和轉(zhuǎn)化光能過程中發(fā)揮著重要作用，因此研究毛竹（Phyllostachys edulis）LHC基因結(jié)構(gòu)及表達模式對于揭示其在毛竹光合作用中的功能具有重要意義。采用生物信息學的方法，對毛竹基因組中的LHC基因進行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明，在毛竹中共有29個LHC基因同源序列，其包含的內(nèi)含子數(shù)量為0～5個。序列分析表明，29個LHC基因編碼的蛋白分別屬于光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ的捕光色素結(jié)合蛋白家族LHCⅠ和LHCⅡ。LHCⅠ包含5個亞家族（Lhca 1—Lhca 5），除了Lhca 4含有3個成員外其他亞家族只有1個成員；而LHCⅡ包含6個亞族（Lhcb 1—Lhcb 6），每個亞家族的成員不同，其中Lhcb 1的成員最多為7個。親疏水性預測表明，不同亞家族成員存在著一定差異。蛋白結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn)，29個蛋白均包含導肽和成熟蛋白，具有跨膜結(jié)構(gòu)域，均包含色素結(jié)合位點；其中12個蛋白的組成以α-螺旋為主，17個蛋白的組成以隨機卷曲為主?；虮磉_譜分析表明，大多數(shù)LHC基因主要在葉片和花序中表達，筍中略有表達，而根和鞭中幾乎檢測不到表達。研究結(jié)果為進一步研究毛竹LHC基因的功能奠定了基礎。

毛竹；LHC基因；結(jié)構(gòu)；表達模式

光合作用是生命賴以生存的基礎，植物利用類囊體膜上的捕光色素結(jié)合（LHC）蛋白復合體接收太陽能并最終同化CO2［1］，LHC蛋白在光能的捕獲、傳遞、轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮著重要作用［2］。LHC是一類在光保護機制中起著關(guān)鍵作用的跨膜蛋白，含3個跨膜螺旋以及結(jié)合葉綠素a、葉綠素b、葉黃素的位點，依據(jù)蛋白參與活動所屬光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）將其分為2個亞類：LHCⅠ和LHCⅡ［3］。近年來對LHC的研究十分活躍，并取得了很大進展，如已經(jīng)對模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和楊樹（Populus trichocarpa）中的LHC基因進行了系統(tǒng)鑒定等［4-6］。

由于竹子速生且用途廣泛，對其研究和開發(fā)利用一直倍受關(guān)注。光合作用是竹子有機物質(zhì)快速積累的源泉，對其研究已涉及生理、生化以及分子生物學等方面，并取得了一定的研究進展。在光合生理方面，毛竹（Phyllostachys edulis）葉片凈光合速率與光照強度、氣溫、緯度的關(guān)系［7-8］，雷竹（Ph. violascens）、綠竹（Bambusa oldhamii）的光合日變化規(guī)律等均有報道［9］。多個光合作用相關(guān)基因已被克隆，包括綠竹cab-BO1、BoLhca4-1以及毛竹中cab-PhE1等［10-12］，不同基因的比較分析包括毛竹、紅殼竹（Ph.iridescens）和角竹（Ph.fimbriligula）中的Lhca基因以及毛竹中的Lhcb基因的分子特征［13-15］，有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)與色素組成已有毛竹Lhcb重組單體和三體的結(jié)構(gòu)與功能分析［16］，但尚缺乏對竹類植物LHC的全基因組分析。

隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展以及生物信息學方法的日漸成熟，毛竹基因組草圖和竹子基因組數(shù)據(jù)庫先后相繼完成［17-18］，使得在全基因組水平上對毛竹中編碼重要功能的基因進行預測和分析成為可能。本研究以毛竹為研究對象，通過生物信息學的方法對毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因的結(jié)構(gòu)及表達模式進行了深入分析，以期為從分子育種角度對毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因功能的開發(fā)與利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.bamboogdb. org/）中下載毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因序列和對應的基因組序列，利用本實驗室前期獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行表達譜分析；擬南芥、水稻捕光色素結(jié)合蛋白基因序列下載于Phytozome v10.3（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。

1.2方法

1.2.1毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因的獲取與進化分析

從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.bamboogdb. org/）下載毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因序列，利用MEGA 6.0軟件內(nèi)置程序Clustal W對毛竹、擬南芥和水稻捕光色素結(jié)合蛋白基因及其編碼的氨基酸序列進行比對分析。根據(jù)序列比對結(jié)果，用MEGA 6.0鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建基于捕光色素結(jié)合蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap值設為5 000，其他參數(shù)均使用系統(tǒng)默認值。依據(jù)聚類關(guān)系，參考擬南芥中的捕光色素結(jié)合蛋白基因命名［19］，對毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因進行系統(tǒng)命名。

1.2.2毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因及蛋白結(jié)構(gòu)分析

用在線軟件Gene Structure Display Server 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因結(jié)構(gòu)［20］；用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白理化特性［21］；用在線軟件ChloroP 1.1 Prediction Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）預測基因編碼的導肽［22］；使用在線軟件SPOMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預測蛋白二級結(jié)構(gòu)［23］；用Phyre 2（http：//www.sbg.bio.ic. ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）來預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)［24］。

1.2.3毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因表達組織特異分析

利用毛竹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從NCBI的Short ReadArchive（SRA）數(shù)據(jù)庫中下載毛竹7個不同組織（葉、鞭、早花期花序、晚花期花序、根、20 cm筍和50 cm筍）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，基因的表達豐度用RPKM表示，每個表達值取以2為底數(shù)的對數(shù)（Log2），并用Matrix2png（http：//www.chibi.ubc. ca/matrix2png/bin/matrix2png.cgi）繪制基因表達圖譜。7個組織中表達量最高的用紅色方框表示，其次有表達的用綠色方框表示，灰色框則表示不表達。

2　結(jié)果與分析

2.1毛竹捕光色素結(jié)合蛋白鑒定與進化分析

通過同源基因比對分析，從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出29個捕光色素結(jié)合蛋白基因的同源序列，數(shù)量高于模式植物水稻（17個）和擬南芥（23個）［19］。進一步分析表明，毛竹29個捕光色素結(jié)合蛋白基因分別屬于LHCⅠ的5個亞家族及LHCⅡ的6個亞家族，其中LHCⅠ的5個亞家族Lhca1—Lhca5中除了Lhca4含有3個成員外都只含有一個成員，而LHCⅡ的6個亞家族Lhcb1—Lhcb6的成員數(shù)量差異較大，其中Lhcb1亞家族成員最多為7個，Lhcb2—Lhcb6亞家族成員依次為3、2、2、3和4個（圖1）。

利用擬南芥、水稻和毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果分析表明，毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因編碼的蛋白進化上與擬南芥的相一致，Lhca1與LHCⅡ的關(guān)系更加相近，而Lhcb6與LHCⅠ的關(guān)系更加相近，Lhca2與其他LHCⅠ成員關(guān)系較遠，而在水稻中Lhca2也只有一個成員，這表明在該亞家族成員進化過程中最可能是以單拷貝的形式存在［25］。已有研究表明，Lhcb4和Lhcb6編碼的蛋白在體內(nèi)主要以單體的形式存在［3］。將毛竹29個捕光色素結(jié)合蛋白基因依次命名（表1）。

圖1　基于毛竹、擬南芥和水稻捕光色素結(jié)合蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

2.2毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因結(jié)構(gòu)分析

對基因結(jié)構(gòu)分析表明，毛竹LHC基因中內(nèi)含子個數(shù)為0～5個不等，但處于同一亞家族成員的外顯子和內(nèi)含子數(shù)量分布相對保守（圖2）。其中，Lhcb1和Lhcb6亞家族基因成員的內(nèi)含子個數(shù)為0個或1個，Lhca5亞家族基因成員內(nèi)含子個數(shù)為5個，Lhca4亞家族基因成員的內(nèi)含子個數(shù)都是2個，Lhcb4亞家族基因成員內(nèi)含子個數(shù)都是1個，內(nèi)含子完全符合GT-AG剪接原則［26］。此外，Lhcb1亞家族中3個成員和Lhcb6亞家族中的2個成員僅含有1個外顯子而沒有內(nèi)含子。基因結(jié)構(gòu)上的差異，意味著其在毛竹生長發(fā)育過程中具有不同的功能。

表1　毛竹中LHC基因

2.3毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基本理化性質(zhì)分析

對毛竹LHC蛋白的基本理化性質(zhì)進行了分析（表1），結(jié)果表明，毛竹LHC蛋白長度存在一定差異，其中LHCⅠ家族成員較為保守（244-271 aa），分子量為26.7～29.5 kDa，PeLhca3.1編碼氨基酸殘基數(shù)目最大為244個，分子量值為29.5 kDa，PeLhca4.3編碼最小244個氨基酸殘基，氨基酸分子量為26.7 kDa；理論等電點pI值為5.65～7.87，除PeL-hca3.1和PeLhca4.4外，其余成員等電點都在酸性范圍內(nèi)，表明蛋白質(zhì)分子中富含酸性氨基酸；蛋白親疏水值范圍為-0.125～0.058；除Lhca5亞家族成員外，其他4個亞家族成員均為親水性蛋白（蛋白親疏水值＜0）；導肽預測結(jié)果顯示，其導肽大小為37～56個氨基酸殘基，成熟蛋白大小為207～15個氨基酸殘基。

圖2　毛竹LHC基因結(jié)構(gòu)

LHCⅡ各亞家族成員編碼蛋白差異較大，達到106～373個氨基酸殘基，分子量值為11.8～39.6 kDa，其中PeLhcb5.1分子量值最大為39.6 kDa，PeLhcb6.3分子量值最小為11.8 kDa；理論等電點pI值為4.78～9.21，但大部分成員氨基酸等電點都在酸性范圍內(nèi)，表明蛋白質(zhì)分子中富含酸性氨基酸；蛋白親疏水值為-0.488～0.463，其中親水性蛋白約占38.1%；導肽預測結(jié)果顯示，除PeLhcb2.3和PeLhcb5.1預測不準確外，其導肽大小為14～50個氨基酸殘基，成熟蛋白大小為92～323個氨基酸殘基。

2.4毛竹捕光色素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指它的多肽鏈中有規(guī)則重復的構(gòu)象，限于主鏈原子的局部空間排列，通過骨架上的羰基和酰胺基團之間形成的氫鍵維持的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，主要包括α-螺旋和β-折疊等［27］。對29條毛竹LHC氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果顯示有12條以α-螺旋為主要組成部分，所占比例范圍為35.47%～49.57%，17條以隨機卷曲為主要組成部分，所占比例為35.09%～48.37%。此外，β-轉(zhuǎn)角（7.32%～14.15%）則散布于蛋白質(zhì)序列中。由于毛竹LHC各亞家族內(nèi)成員的三級結(jié)構(gòu)非常相似，因此在每個亞族中選取1個有代表性的成員進行三級結(jié)構(gòu)預測。結(jié)果顯示，11個亞家族蛋白質(zhì)PeLhca1.1、PeLhca2.1、PeLhca4.1、PeLhcb1.3、PeLhcb2.1、PeLhcb3.1和PeLhcb6.2都有5個α-螺旋；PeLhca3.1和PeLhca5.1的α-螺旋是7個；PeLhcb5.2的α-螺旋是6個（圖3）。蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是由α-螺旋、β-折疊和隨機卷曲等共同組成，雖然部分毛竹LHC蛋白α-螺旋個數(shù)一樣，但由于29條毛竹LHC蛋白中隨機卷曲均占很大比例，且它們的長度都不相同，可能會造成蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)有所不同，進而決定了其功能上的差異。

圖3　毛竹11個代表性LHC蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.5毛竹捕光色素結(jié)合蛋白基因表達模式分析

根據(jù)毛竹不同組織的表達譜數(shù)據(jù)，對毛竹LHC基因的組織表達模式進行分析。結(jié)果顯示，除PeLhcb2.3僅在葉和早花期花序中表達且表達峰度很低外，毛竹LHC基因在葉、早花期花序和晚花期花序中表達量均很高，在根、鞭、20 cm和50 cm高的筍中表達量均很低，尤其是在鞭中，大部分LHC基因表達量極低甚至不表達（圖4），這與LHC基因由核基因編碼，在類囊體膜上結(jié)合不同色素或結(jié)合其他天線蛋白來行使其生物學功能的特性相符合［28］。在毛竹中找到的2個Lhcb4基因PeLhcb4.1和PeLhcb4.2，其表達量較高且相似，這與擬南芥中發(fā)現(xiàn)的3個Lhcb4基因，其中2個表達量很高且表達量相類似，而另外一個表達量則很低［3］。

3　討論

光合作用一直是生命科學研究中的熱點之一，尤其是以綠色經(jīng)濟為社會發(fā)展主題的今天，植物光合作用的研究倍受關(guān)注。人們除了從形態(tài)、生理角度來開展研究外，已經(jīng)深入到分子、蛋白水平，并與生理、生化研究緊密結(jié)合起來，正在從微觀結(jié)構(gòu)來揭示光合作用的分子機制。研究顯示所有結(jié)合葉綠素a/b的生物體都有LHCⅡ同系物，其蛋白均具有一個三聚體結(jié)構(gòu)（WYGDR motif）［29］。Kargul等模仿了衣藻中LHC-PSⅠ超復合體的結(jié)構(gòu)，并預測有11個LHCⅠ蛋白呈月牙形排在每個PSⅠ復合體一側(cè)［30］。通過對豌豆（Pisum sativum）的超級膜蛋白PSⅠ-LHCⅠ（600 kDa）的晶體結(jié)構(gòu)研究，分辨率達2.8埃，揭示出蛋白復合體的結(jié)構(gòu)，尤其是LHCⅠ內(nèi)色素和其他協(xié)同因子的排列方式，以及PSⅠ核心與LHCⅠ的相互作用［31］。對竹類植物PSⅠ和PSⅡ結(jié)構(gòu)與功能的研究剛剛起步，更缺乏生理、生化、分子與結(jié)構(gòu)之間的有機結(jié)合。

圖4　毛竹LHC基因在7個組織中的表達分析

高等植物通過2大色素——蛋白復合體PSⅠ和PSⅡ來實現(xiàn)太陽能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W能，遺傳物質(zhì)是決定其光合作用過程的內(nèi)在基礎，基因結(jié)構(gòu)決定著其蛋白結(jié)構(gòu)，而蛋白一級結(jié)構(gòu)又是決定了蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)［32］。對竹類植物PSⅠ和PSⅡ中重要組分LHC結(jié)構(gòu)與功能的認知將是從分子水平全面認識其光合作用的基礎。因此，本研究充分利用毛竹基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，借助利用生物信息學方法，對毛竹基因組中的捕光色素蛋白基因家族進行了系統(tǒng)鑒定，明確了該基因家族29個成員的類別、結(jié)構(gòu)、進化以及表達特性等基本信息，對于深入了解毛竹類捕獲、傳遞、轉(zhuǎn)化光能的過程，及其在維持類囊體膜的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)激發(fā)能在PSⅠ和PSⅡ之間分配中的作用具有重要價值?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建的表達譜尚存在一定的不確定性，如PeLhcb2.3在葉片中竟然沒有檢測到表達，因此毛竹LHC基因的表達尚需要通過實驗進一步驗證。

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Structure and Expression Analysis of Light-harvesting Chlorophyll a/b Binding Protein Genes in Moso Bamboo（Phyllostachys edulis）

Li LichaoSun HuayuLou YongfengZhao HanshengGao Zhimin
（International Center for Bamboo and Rattan，Key Laboratoryof State Forestry Administration on the Science and Technology of Bamboo and Rattan，Beijing 100102，China）

Plants convert the solar energy into chemical energy through photosynthesis，and the light-harvesting chlorophyll a/b binding（LHC）protein plays a crucial role in the process of energy capture，transfer and conversion.Therefore，the study on the structure and expression pattern of LHC genes is of great significance to reveal their functions in photosynthesis of moso bamboo（Phyllostachys edulis）.A genome-wide analysis of LHC genes in moso bamboo was carried out using bioinformatics methods.The results showed that there were 29 LHC homologous genes in moso bamboo，of which the intron numbers ranged from 0 to 5.On the basis of sequence analysis，the proteins encoded by 29 LHC genes belonged to LHCⅠin PSⅠand LHCⅡin PSⅡrespectively.LHCⅠcontained 5 subfamilies（Lhca1-Lhca5），each of which only had one member except Lhca 4 with 3 members，while LHCⅡcontained 6 subfamilies（Lhcb1-Lhcb6）which have a varied range of members each，among which Lhcb1 subfamily had a maximum of seven members.Hydrophilic and hydrophobic prediction demonstrated that there was a certain difference in the members of different subfamilies.The results of protein structure prediction showed that all the 29 proteins encoded by LHC genes was composed of transit peptide and mature protein，which contained transmembrane structure and pigment binding sites.There were 12 proteins predicted with priority of alpha helix and 17 proteins with priority of random curl.The analysis of gene expression profile suggested that most of LHC genes mainly express in leaves and panicles，and few in shoot，but almost undetectable in rhizome and root.Overall，these results laid a significant foundation for further study on the LHC gene function in moso bamboo.

Moso bamboo，LHC gene，gene structure，expression pattern

10.13640/j.cnki.wbr.2015.06.001

國家自然科學基金“竹子葉黃素循環(huán)分子調(diào)節(jié)機制研究”（編號：31370588）；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項“毛竹核心種質(zhì)重測序及竹壁發(fā)育關(guān)鍵基因研究”（編號：201504106）。

李利超，在讀碩士生，從事竹子分子育種研究。E-mail：lilicao1991@126.com。

高志民，男，研究員，博士生導師，研究方向為竹藤生長發(fā)育的分子基礎。E-mail：gaozhimin@icbr.ac.cn。