吳康郁，袁偉彬，黃偉斌

廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 510240

◆實驗研究論著◆

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化苧麻根總黃酮超聲提取工藝

吳康郁，袁偉彬，黃偉斌

廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 510240

目的：采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化苧麻根中總黃酮的超聲提取工藝。方法：在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、料液比、超聲時間為自變量，總黃酮得率為因變量，通過效應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝條件，并進行預(yù)測分析。結(jié)果：最佳提取工藝為：乙醇濃度為63%，料液比為1∶33，超聲時間為53min。結(jié)論：優(yōu)選的超聲提工藝所得結(jié)果精確、簡便，且預(yù)測性良好。

苧麻根；總黃酮；星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法；超聲提取

苧麻根，別名苧麻頭、苧根、銀苧等，為蕁麻科苧麻屬植物苧麻Boehmeria nivea（L.）Gaud的干燥根。其性寒，味甘，歸心、肝經(jīng)，具有涼血止血、安胎、利尿、清熱解毒之功效，主治血熱妄行之咯血、吐血、衄血、胎漏下血，及熱毒癰腫、丹毒、毒蛇咬傷、跌打扭傷等。有研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物是苧麻根的主要成分之一［1］。筆者用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化其總黃酮超聲提取工藝，所取得工藝條件重復(fù)性較好，數(shù)據(jù)準確度優(yōu)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器 BUG40-12超聲波清洗器［必能信超聲（上海）有限公司］；UV2300分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；XFB-400高速多功能粉碎機（吉首市中誠制藥機械廠）；AE-240電子天平（上海梅特勒一托利多有限公司）。

1.2 實驗藥品 蘆丁對照品購于中國藥品生物制品檢定所；苧麻根購于毫州健仁藥材有限公司，經(jīng)鑒定為蕁麻科苧麻屬植物苧麻的干燥根；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2 方法及結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備及標準曲線的繪制 見圖1。精密稱取蘆丁標準品13.6mg，置于50m L容量瓶中，用70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，即得0.272 m g/m L的蘆丁對照品溶液。精密吸取上述蘆丁對照品溶液0.5、1、1.5、2.0、2.5、5 m L置25 m L量瓶中，加70%乙醇溶液至10 m L，加5%亞硝酸鈉溶液0.5 m L，搖勻靜置5m in后，加10%硝酸鋁溶液0.5 m L，搖勻后靜置5 min，再加0.5 m ol/L氫氧化鈉溶液2 m L，搖勻，加70%乙醇定容至25 m L，靜置0.5 h，在510 nm下測定其吸光度（A）。以A為縱坐標，蘆丁標準品濃度C（μg/m L）為橫坐標，得回歸方程y=0.015x+0.0004（r=0.9998），線性范圍5.44～54.4μg/m L。

圖1 蘆丁對照品標準曲線

2.1.2 樣品中總黃酮含量測定 取一定提取條件下所得的供試品溶液，在510 nm處測定樣品的吸光度。根據(jù)2.1.1.項下標準曲線計算樣品中總黃酮的濃度C。總黃酮得率計算公式：總黃酮得率（%）=［（C×V×D）/m］×100%。式中：C為特定條件下提取所得總黃酮的濃度，V為特定條件下提取所用溶劑的量，D為樣品的稀釋倍數(shù)，m為樣品取樣量。

2.1.3 精密度試驗 精密量取2.1.1項下蘆丁對照品溶液，重復(fù)測定6次吸光度A，結(jié)果RSD值為0.83%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 供試樣品溶液的制備 精密稱取藥材粗粉約1 g，置于100 m L錐形瓶中，加入70%乙醇25 m L，30℃條件下超聲處理（功率300W，頻率50kHz）20 min，取出，靜置，移取上清液5m L至10m L容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取藥材粗粉約1 g，按2.1.4項下的方法制備供試品溶液，室溫放置，在第0，1，2，4，6，8，12 h分別測定吸光度A，并按2.1.2項下方法計算總黃酮得率的RSD值為1.72%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密稱取6份藥材粗粉，均約1 g，按2.1.4項下的方法制備供試品溶液，分別測定吸光度A，并按2.1.2項下方法計算總黃酮得率的RSD值為1.47%，表明方法的重復(fù)性很好。

2.1.7 加樣回收率試驗結(jié)果 見表1。精密稱取已知含量藥材粗粉6份，均約0.5 g，精密加入2.1.1項下對照品溶液9.2m L，按2.1.4項下的方法制備供試品溶液，分別測定吸光度 A，計算加樣回收率。平均加樣回收率為 100.09%，RSD%=0.59%，表明提取方法回收率良好。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對總黃酮得率影響試驗 精密稱取6份藥材粗粉，均約1 g，分別加入濃度為30%、45%、60%、75%、90%乙醇和無水乙醇25m L，在超聲溫度40℃、超聲功率120W條件下超聲40 min，以考察乙醇濃度對總黃酮得率的影響，結(jié)果總黃酮得率分別為0.426%、0.454%、0.491%、0.483%、0.469%、0.452%，由試驗數(shù)據(jù)得知，乙醇濃度對總黃酮得率有一定影響。

2.2.2 料液比對總黃酮得率影響試驗 精密稱取6份藥材粗粉，均約1g，分別按1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45為比例加入70%乙醇溶液，在超聲溫度40℃、超聲功率120W條件下超聲40min，以考察料液比對總黃酮得率的影響，結(jié)果總黃酮得率分別為 0.417%、0.446%、0.487%、0.478%、0.466%、0.476%，由試驗結(jié)果可知，料液比對總黃酮得率有一定影響。

2.2.3 超聲溫度對總黃酮得率影響試驗 精密稱取6份藥材粗粉，均約1 g，加入70%乙醇溶液25m L，超聲溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，超聲功率為120 W，超聲40min，以考察超聲溫度對總黃酮得率的影響，結(jié)果總黃酮得率分別為0.472%、0.477%、0.481%、0.482%、0.480%、0.479%，由試驗結(jié)果可知，超聲溫度對總黃酮得率影響較小。

2.2.4 超聲功率對總黃酮得率影響試驗 精密稱取6份藥材粗粉，均約1 g，加入70%乙醇溶液25m L，超聲溫度40℃，超聲功率分別為60W、120W、180W、240 W、300 W，超聲40min，以考察超聲功率對總黃酮得率的影響，結(jié)果總黃酮得率分別為 0.453%、0.478%、0.484%、0.489%、0.494%、0.497%，由試驗結(jié)果可知，超聲功率對總黃酮得率有一定影響。

2.2.5 超聲時間對總黃酮得率影響試驗 精密稱取6份藥材粗粉，均約1 g，加入70%乙醇溶液25m L，超聲溫度40℃，超聲功率120 W，分別超聲20 m in、30 m in、40 m in、50m in、60 m in、70 min，以考察超聲時間對總黃酮得率的影響，結(jié)果總黃酮得率分別為0.426%、0.441%、0.467%、0.505%、0.486%、0.473%，由試驗結(jié)果可知，超聲時間對總黃酮得率有一定影響。

2.3 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化苧麻根中總黃酮超聲提取工藝

2.3.1 試驗設(shè)計與結(jié)果 見表2、表3。在單因素基礎(chǔ)上，確定乙醇濃度、料液比和超聲時間為考察因素，以總黃酮得率為指標，根據(jù)星點設(shè)計原理，每個因素確定5個水平，用代碼-α、-1、0、1、α來表示（3因素星點設(shè)計的α=1.682），代碼所代表的實際操作物理量星點實驗設(shè)計與結(jié)果。0.14X1+0.12X2+0.029X3+8.750E-003X1X2+0.076X1X3+3.750E -003X2X3-0.22X12-0.21X22-0.13X32。 回 歸 方 程 系 數(shù) r= 0.975，說明該模型能解釋95.11%響應(yīng)值的變化，這也說明本回歸方程的代表性很好，能夠較為準確的預(yù)測實際情況。其校正決定系數(shù)（adj-R2）為r=0.95，表明該模型擬合程度良好，該回歸模型能解釋95%的試驗數(shù)據(jù)的變化，有大約5%不能用該模型進行解釋。綜上所述，該模型能較好地解釋響應(yīng)值的變化，可考慮用該回歸模型代替試驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。模型的F=39，P＜0.0001，表明只有小于0.01%的失誤率?；貧w模型方差顯著性檢驗表明，一次項乙醇濃度和料液比對總黃酮得率的線性效應(yīng)極顯著，三因素的二次項對總黃酮得率的線性效應(yīng)均極顯著，一次項超聲時間對總黃酮得率的線性效應(yīng)顯著，交互項的P值均＞0.05，說明各因素間的交互作用無統(tǒng)計學(xué)意義。將其中兩個因素與因變量擬合為三維曲面圖，在圖上選取提取含量較佳工藝范圍：乙醇濃度X1：45%～75%；料液比X2：1∶20～1∶40；超聲時間X3：40～60m in。依據(jù)效應(yīng)值選擇極大值，得到最佳提取工藝條件：乙醇濃度為63.26%，料液比為1∶33.12，超聲52.24min，此時總黃酮得率達到最大值為0.521%。考慮實際生產(chǎn)操作，將各因素取整改為：乙醇濃度為63%，料液比為1∶33，超聲時間為53m in。2.4 驗證試驗 為了驗證所得模型的適應(yīng)性和準確性，按2.3.2項下得到最佳工藝條件提取并測定總黃酮得率，重復(fù)試驗3次，總黃酮得率分別為：0.523%、0.518%、0.519%，平均總黃酮得率為0.52%，RSD%=0.484%，試驗數(shù)據(jù)表明，通過模型優(yōu)選出的工藝條件重現(xiàn)性良好。預(yù)計值為0.518%，偏差為-0.579%＜5%，表明該模型較為可靠。

表2 星點設(shè)計因素及水平

表3 星點試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

2.3.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 見表4、圖2、圖3、圖4。應(yīng)用Design-Expert8.0.5b軟件對所得數(shù)據(jù)進行效應(yīng)面試驗分析，得到為乙醇濃度（X1）、料液比（X2）及超聲時間（X3）與總黃酮得率（y）之間的二次多項回歸方程，回歸方程為：y=5.12+

圖2 乙醇濃度和料液比響應(yīng)面圖

圖3 乙醇濃度和超聲時間響應(yīng)面圖

圖4 料液比和超聲時間響應(yīng)面圖

3 討論

苧麻根是一味常用的中藥材，黃酮類化合物是苧麻根的主要成分之一，其生物活性較為廣泛，研究苧麻根的超聲提取工藝具有重要的意義。目前中藥中總黃酮提取工藝的優(yōu)選多采用正交設(shè)計或均勻設(shè)計，但正交設(shè)計和均勻設(shè)計都是基于線性模型的設(shè)計，存在一定缺陷。星點設(shè)計-效應(yīng)面法可進行非線性擬合，能提高數(shù)學(xué)模型的預(yù)測性，更好地體現(xiàn)各因素、指標與效應(yīng)值的關(guān)系［2］。筆者先用單因素試驗考察對總黃酮得率有影響的相關(guān)因素，篩選出乙醇濃度、料液比和超聲時間等3個影響較大的因素，然后用星點設(shè)計-效應(yīng)面法建立上述3個因素與總黃酮得率之間關(guān)系的模型，并對苧麻根超聲提取工藝進行了優(yōu)化，得到苧麻根中超聲提取總黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度為63%，料液比為1∶33，超聲時間為53 m in。在該工藝條件下得到的結(jié)果較為精確，重現(xiàn)性良好，所得模型較為可靠，預(yù)測性良好。

［1］許瓊明，陳國慶，范金胤，等.苧麻根化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2009，34（20）：2610-2612.

［2］孟江，許舒婭，盧國勇，等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化姜炭炮制工藝［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（2）：8-11.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Optimization of Ultrasonic Extraction Process of Total Flavonoids in Radix Boehmeriae by Central Composite Design-Response Surface Methodology

WU Kangyu，YUAN Weibin，HUANG Weibin

Objective：To optimize the ultrasonic extraction process of the total flavonoids from radix boehmeriae by centralcomposite design- response surface methodology.Method：Based on the single factor experiment，ethanol concentration，solid- liquid ratio and ultrasonic time were selected as independent variables， the yield of total flavonoids was used asdependent variable，and the ultrasonic extraction process was optimized by response surface methodology. And then predictiveanalysis was carried out to compare the value.Results：The optimal technological parameters were as follows：ethanolconcentration was 63％，solid- liquid ratio was 1∶33，and ultrasonic time was 53 min. Conclusion：The ultrasonic extractionprocess optimized by central composite design /response surface methodology is convenient，precise，and highly predictive.

Radix Boehmeriae；Total flavonoids；Central composite design-response surface methodology；Ultrasonic extraction

R284.2

A

0256-7415（2015）08-0262-04

10.13457/j.cnki.jncm.2015.08.121

2015-01-04

廣東省中醫(yī)藥局科研課題（20131224）

吳康郁（1973-），男，主管中藥師，研究方向：醫(yī)院制劑研發(fā)。