黃　娟　羅運春★

Galectin-3在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用及低分子柑桔果膠的干預(yù)

黃娟羅運春★

目的 探討小鼠肺組織半乳糖凝集-3（Galectin-3）表達水平及其與支氣管哮喘的關(guān)系，研究低分子柑桔果膠（LCP）對哮喘小鼠肺組織Galectin-3表達及TH1/TH2平衡的影響。方法 用卵清白蛋白建立哮喘模型。將BALB/c小鼠隨機分為五組：正常對照組（A組）、哮喘組（B組）、低分子柑桔果膠預(yù)防組（C組）、低分子柑桔果膠治療組（D組）和地塞米松治療組（E組），每組10只。留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）進行細(xì)胞總數(shù)計數(shù)和分類計數(shù)；應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測BALF中ⅠL-4、ⅠFN-γ濃度，采用免疫組化和RT-PCR法分別檢測Galectin-3蛋白和Galectin-3 mRNA的表達。結(jié)果 哮喘組肺組織中 Galectin-3蛋白和Galectin-3 mRNA表達的強度均高于對照組，LCP預(yù)防組和治療組均顯著低于哮喘組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。Galectin-3及其mRNA表達與BLAF中的ⅠL-4濃度成顯著正相關(guān)（r=0.791、0.761，P＜0.01），而與BLAF中的ⅠFN-γ濃度成顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.668、0.634，P＜0.01）。結(jié)論 哮喘小鼠肺組織Galectin-3高度表達，參與氣道炎癥的發(fā)生，LCP干預(yù)后下調(diào)Galectin-3表達，糾正Th1/Th2失衡。

哮喘 半乳糖凝集素-3 ⅠL-4 ⅠFN-γ 低分子柑桔果膠

半乳糖凝集素（Galectin）是一類能選擇性識別糖結(jié)構(gòu)并與之非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)，廣泛分布于細(xì)胞表面、胞質(zhì)、胞核及細(xì)胞外基質(zhì)中。研究顯示，半乳糖凝集素3（Galectin-3）可能與支氣管哮喘的發(fā)病機制密切［1～3］。改良柑橘果膠（MCP）又稱低分子柑桔果膠（LCP），其主要成分是半乳糖，能競爭抑制體內(nèi)的Galectin-3配體，有效封閉和阻斷Galectin-3的功能表達。作者通過建立哮喘小鼠模型，采用免疫組化和RT-PCR技術(shù)，檢測Galectin-3在氣道和肺組織中的表達，同時采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）對外周血中白細(xì)胞介素4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）的含量進行測定，觀察LCP對Galectin-3蛋白、mRNA及TH1/TH2平衡的影響，為哮喘發(fā)病機制及防治開辟新的思路。

1　材料與方法

1.1小鼠哮喘模型的建立 SPF級BALB/c雄性小鼠50只（由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供），21～35d，體重14～18g，隨機分為正常對照組（A組）、哮喘組（B組）、LCP預(yù)防組［LCP粉2400mg/（kg.d）］（C組）、LCP治療組［LCP粉2400mg/（kg·d）］（D組）和地塞米松治療組（0.5mg/kg）（E組）。每組10只。采用V級OVA制備模型，哮喘模型的制作參照文獻［4］的方法略作改進。分致敏、激發(fā)兩個階段，LCP預(yù)防組分別于第1天開始每天AM 8：30按2400mg/kg灌胃LCP；第8天和第21天腹腔注射0.1ml含1%OVA的Al（OH）3凝膠致敏，各一次，共2次，第32天開始使用空氣壓縮霧化器向置于密閉有機玻璃容器內(nèi)的小鼠噴霧1%OVA，每天吸入30min，連續(xù)定時激發(fā)1周。LCP治療組于激發(fā)前每天AM 8：30按2400mg/kg灌胃LCP。地塞米松治療組于每次激發(fā)前1h按0.5mg/ kg腹腔注射地塞米松液0.1ml。對照組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。

1.2 實驗方法 各組末次激發(fā)24h內(nèi)處死，眼球動脈取血，收集血清，每只小鼠左肺迅速留取肺組織，部分透明，石蠟包埋連續(xù)切片，用以光電鏡標(biāo)本制作和免疫組化，右肺進行支氣管肺泡灌洗并留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）經(jīng)2000rpm/min離心15min，取上清液-80℃ Eppendorf管保存用以檢測IFN-γ和IL-4濃度。支氣管肺泡灌洗小鼠收取BALF，細(xì)胞分類計數(shù)使用瑞士染色。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定BALF中IFN-γ、IL-4濃度，測定方法按試劑說明書進行操作。

1.3RT-PCR法測肺組織Galectin-3 mRNA的表達 引物設(shè)計和合成：檢索GenBank數(shù)據(jù)庫中mouse Galectin-3、GAPDH的mRNA序列，由上?；瞪锕こ逃邢薰驹O(shè)計并合成引物，Galectin-3：F 5，CCCGCATGCTGATCACAA 3，R 5 GGAGGTTCTTCATCCGATGGT 3；GAPDH F 5 CAAGTTCAACGGCACAGTCAA 3；R 5 TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC 3.

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way-ANOVA），兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett'T3檢驗，兩變量的相關(guān)采用Pearson相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HE染色觀察 哮喘組小鼠肺組織切片HE染色可見肺內(nèi)支氣管黏膜下、肺內(nèi)支氣管及血管周圍較多炎性細(xì)胞浸潤，以EOS、Lym、Neu為主，黏膜下水腫，黏液腺增生，黏膜皺折增多，氣道上皮多處斷裂和上皮細(xì)胞脫落，肺間質(zhì)和支氣管腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞滲出和分泌物，支氣管壁略顯增厚和基底膜輕度增厚且不規(guī)則，細(xì)支氣管平滑肌輕度肥大。LCP預(yù)防組、治療組及地塞米松治療組小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤等病理改變較哮喘組減輕。

2.2PAS染色觀察 正常對照組小鼠肺組織切片PAS染色未見黏液分泌；哮喘組PAS染色可見氣道上皮杯狀細(xì)胞增生肥大，大量黏液形成，并可見氣管腔內(nèi)黏液栓；LCP預(yù)防組、治療組及地塞米松治療組肺組織PAS染色與哮喘組比較，杯狀細(xì)胞增生不明顯，黏液分泌明顯減少。

2.3電鏡觀察 正常對照組小鼠顯示正常肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（可見板層小體）支氣管纖毛上皮細(xì)胞纖毛排列齊整，肺泡隔結(jié)構(gòu)正常，表面微絨毛豐富；未見淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞附壁及浸潤；肺細(xì)小動脈內(nèi)膜、中膜、外膜清晰，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，平滑肌細(xì)胞之間有散在的膠原纖維，哮喘組小鼠電鏡觀察顯示肺間質(zhì)有EOS浸潤，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞水腫，核輕度固縮，胞漿部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，表面微絨毛部分脫落，線粒體輕度腫脹。支氣管纖毛上皮細(xì)胞纖毛排列稀疏，有斷裂、融合現(xiàn)象；肺泡腔及血管壁有多個巨噬細(xì)胞浸潤。

2.4各組小鼠BALF中細(xì)胞計數(shù)與分類計數(shù)的比較 見表1。

表1　各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)（±s）

表1　各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)（±s）

注：與A組比較*P＜0.01；與B組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別鼠數(shù)細(xì)胞總數(shù)（×107/L）細(xì)胞分類計數(shù)（%）LymNEUMфEOS A組1022.40±1.06.35±0.955.13±0.4898.75±.6.230.61±.0.03 B組10100.28±2.24*11.61±0.35*11.87±0.48*66.90±9.75*11.33±.0.72* C組858.40±4.43*△△9.80±1.14*8.91±1.26*△70.54±10.81*6.31±.0.32*△D組991.43.± 5.48*15.36±3.01*10.15±.1.01* 67.78±8.54*8.85±.1.39*△E組1037.73±2.67*△△8.87±0.68*△△8.81±0.97*△80.42±2.38*△2.51±.0.32*△△

2.5各組BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化 見表2。

表2　各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化［pg/ml，（±s）］

表2　各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化［pg/ml，（±s）］

注：與A組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較△P＜0.05

組別鼠數(shù)（只）IFN-γIL-4 A組818.85±7.3237.14±3.70 B組86.20±4.38**148.87±30.90** C組89.42±4.69**75.54±10.03**△D組87.24±3.21**98.40±28.80* E組88.65±3.39**72.42±7.96**△F值6.8634.60

2.6肺組織中Galectin-3蛋白和Galectin-3 mRNA的變化 見表3。

表3　各組小鼠肺組織Galectin-3蛋白表達情況（±s）

表3　各組小鼠肺組織Galectin-3蛋白表達情況（±s）

注：與A組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較△P＜0.05，△△P＜0.01

組別鼠數(shù)（只）Galectin-3蛋白Galectin-3 mRNA A組100.18±0.030.20±0.07 B組100.32±0.01**0.39±0.01** C組80.25±0.01**△△0.34±0.01*△△D組90.29±0.01**△0.34±0.03*△E組100.22±0.02**△△0.29±0.01△△F值80.9138.82

RT-PCR顯示肺組織Glectin-3 mRNA表達：B組高于A組（P＜0.01），C、D、E組均低于B組（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）。相關(guān)分析顯示，肺組織中Galectin-3、Glectin-3 mRNA含量與BALF中IL-4濃度分別成正相關(guān)［（r=0.791，P＜0.01），（r=0.761，P＜0.01）］；而Glectin-3 mRNA含量與BALF中IFN-γ濃度成負(fù)相關(guān)［（r=-0.668，P＜0.01，（r=-0.634，P＜0.01）］。

3　討論

支氣管哮喘是全球范圍內(nèi)威脅公眾健康的最常見慢性呼吸道疾病，發(fā)病機制還未完全明確。近年來Galectin在哮喘中的作用逐漸引起重視，已成為探討哮喘發(fā)病機制及治療的新方向。

Galectin屬于可溶性免疫調(diào)節(jié)蛋白，能通過調(diào)節(jié)信號通路在胞內(nèi)發(fā)揮作用，或作為生物活性調(diào)節(jié)介質(zhì)在胞外發(fā)揮作用，在炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附和腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［5］Galeetin-3是這個家族最具特征的成員，由一個長的N末端結(jié)構(gòu)域（調(diào)節(jié)區(qū)）和C末端的單一糖識別域（CRD結(jié)構(gòu)域），其羧基端是糖識別域組成。它是一種多效蛋白，主要表達于上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及各種炎癥細(xì)胞中［6］。Cecilia等［7］報道支氣管哮喘患者Galectin-3主要高表達在氣道上皮細(xì)胞，腺上皮，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。其通過與其糖結(jié)合物配體等結(jié)合，使得其N末端調(diào)節(jié)區(qū)形成寡聚化參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，細(xì)胞增殖、單核巨噬細(xì)胞趨化、內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成及信號傳導(dǎo)等。其它機制包括通過結(jié)合這些細(xì)胞表面的肽聚糖激活多種類型炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)。外源性的Galectin-3與T細(xì)胞表面的糖蛋白結(jié)合，可直接介導(dǎo)T細(xì)胞的死亡［1］。Zuberi等［8］研究發(fā)現(xiàn)Galectin-3基因敲除（Lgals3-/-）急性哮喘小鼠模型，顯示出明顯降低的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和杯狀細(xì)胞生成亦明顯減少。Xiao等［2］進一步研究發(fā)現(xiàn)Galectin-3基因敲除的慢性哮喘小鼠模型顯示出氣道重塑明顯受抑制，主要表現(xiàn)在嗜酸性粒細(xì)胞聚集減少，IL-5 和 IL-13表達下調(diào)，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子（eotaxin）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-b1）及血管生成介質(zhì)明顯減少。作者通過BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)發(fā)現(xiàn)由OVA激發(fā)的支氣管哮喘小鼠模型嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)明顯增高，免疫組化和RT-PCR觀察哮喘小鼠肺組織Galectin-3的表達明顯增高，主要表達于氣道上皮細(xì)胞及散在的炎性細(xì)胞，與文獻報道一致。Galectin-3表達與BALF細(xì)胞總數(shù)、嗜酸粒細(xì)胞百分比、IL-4濃度的濃度呈正相關(guān)變化。說明哮喘氣道上皮細(xì)胞和肺組織Galectin-3的過度表達很可能是導(dǎo)致哮喘氣道炎性細(xì)胞募集和炎性介質(zhì)分泌增多的主要原因。從而證實Galectin-3參與哮喘發(fā)病機制。因此，探討如何通過藥物抑制肺組織Galectin-3的高表達對調(diào)控哮喘氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展有重要價值。

柑桔果膠（CP）是從柑橘類植物細(xì)胞壁中提取的一種支鏈天然多糖，其主要成分是半乳糖，LCP則是CP經(jīng)過特定Ph值和溫度處理后，分支結(jié)構(gòu)減少，更富含半乳糖和糖鏈結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物［3］。CP和LCP自身對細(xì)胞Galectin-3的表達和分泌無影響。LCP作為Galectin-3的高親和力配體與Galectin-3的CRD作用，競爭抑制體內(nèi)的Galectin-3配體［9］。此外由于其分子量小，無抗原性，無毒性，水溶性好，容易被胃腸道吸收而進入血液系統(tǒng)發(fā)揮作用，對機體的特異性和非特異性免疫產(chǎn)生影響 。PlattD 等［9］通過體外細(xì)胞凝集試驗和細(xì)胞粘附試驗證實，LCP可通過封閉細(xì)胞表面的galectin-3而抑制細(xì)胞間的相互識別和粘附功能。目前國內(nèi)外已用于腫瘤領(lǐng)域的臨床治療。而在糖尿病、高血脂、鉛中毒等方面的防治也正成為研究的熱點。是否LCP能用于哮喘的防治，目前國內(nèi)外尚無報道。

本資料首次發(fā)現(xiàn)LCP預(yù)防組、治療組肺組織支氣管及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，BALF液涂片EOS%較正常組明顯下降，BALF液中IL-4濃度降低；免疫組化和RT-PCR顯示LCP預(yù)防組的氣道、肺組織Galectin-3及mRNA表達較哮喘組明顯下降，表明低分子柑橘果膠減輕哮喘小鼠肺部炎癥反應(yīng)，一定程度上增強Th1免疫反應(yīng)或抑制亢進的Th2免疫反應(yīng)，從而改善哮喘發(fā)病機制中Th1/Th2的失衡。其發(fā)生機制可能與上述的競爭抑制體內(nèi)的Galectin-3配體和自身的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。本實驗還發(fā)現(xiàn)地塞米松治療組顯著降低的Galectin-3表達，與文獻報道一致［10］，但激素長期治療哮喘的副作用不容忽視。LCP聯(lián)合激素治療是否有協(xié)同作用，是否能降低激素的用量是未來研究的方向。LCP無毒性，來源于水果，資源豐富，價格低廉，且不會與藥物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，其開發(fā)應(yīng)用價值和潛力巨大，望能為哮喘的預(yù)防治療開辟新的途徑。

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2 Xiao Na Ge， Nooshin S. Bahaie， Bit Na Kang et al. Allergen-Induced Airway Remodeling Is Impaired in Galectin-3 Deficient Mice J Immunol.2010，185：1205～1214.

3 Nangia-Makker P，Hogan V， Honjo Y，et al. Inhibition of human cancer cell growth and metastasis in nude mice by oral intake of modified citrus pectin . J Natl Cancer Inst，2002，94：1854～1862.

4 李昌崇，張維溪，陳小芳，等.巨噬細(xì)胞炎性蛋白1及其mRNA在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用.中華兒科雜志，2004，42（2）：90～93.

5 Rabinovich GA， Toscano MA. Turning 'sweet' on immunity： galectinglycan interactions in immune tolerance and inflammation. Nat Rev Immunol， 2009， 9（5）： 338～352.

6 Yang R Y，Rabinovich G A，Liu F T. Galectins： structure，function and therapeutic potential .Expert Rev Mol Med，2008，10：el7.

7 Cecilia C， Johan M， Kristian N. et al. Glycoproteomic identification of galectin-3 and -8 ligands in bronchoalveolar lavage of mild asthmatics and healthy subjects. Biochimica et Biophysica Acta 1820 （2012）1429～1436.

8 Zuberi RI， Hsu DK， Kalayci O， et al. Critical role for galectin-3 in airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma. Am J Pathol， 2004， 165（1）：2045～2053.

9 Platt D， Raz A . Modulation of the lung colonization of B16-F1 melanomacells by citrus pectin J Natl Cance rInst，1992， 84 （ 6 ） ： 438～ 442 .

10 Dabelic S， FlogeI M， Dumic J.Hydrocortisone and dexamethasone affect the galectin-3 expression Period biol，2005，107：175～181.

Objective To evaluate the expression of galectin-3 in mice lung tissue，and to explore the role of galectin-3 in the bronchus of a mouse model of asthma. To access the effect of Low-Molecular-Weight Citrus Pectin（ LCP） on the expression of Galectin-3，Galectin-3mRNA and the level of Th1/Th2 balance. Methods Fifty male BALB/c mice were randomly divided into fi ve groups ： the control group，asthma group，LCP prevented group and LCP treated group and dexamethasone treated group.Ⅰn the experiment，the mouse model of asthma was established by the ovalbumin（ OVA） challenge Methods. Counts of total cell numbers and differentiated cell numbers in bronchoalveolar lavage .The protein expression of Galectin-3 was detected by Ⅰmmuno-histochemistry（ⅠHC）； the mRNA expression of Galectin-3 was detected by transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）. Results Ⅰmmunohistochemical staining and transcriptase polymerase chain reaction showed that the protein content of Galectin-3 and Galectin-3mRNA expression in the lung tissue of asthma group were significantaly higher than that of the control group，while those of LCP prevented group and LCP treated group were signifi cantly lowed than asthma group .（P＜0.05 or P＜0.01）. The Galectin-3 and the Galectin-3mRNA expression had positive correlation with the concentration of ⅠL-4 in BALF.（r=0.791、0.761，P＜0.01） while had negative correlation with the ⅠFN-γin BALF.（r=-0.668、0.634，P＜0.01） Conclusion Galectin-3mRNA and Galectin-3 were strongly expressed in airway and lung of sensitized mouse. LCP can downregulate expression of Galectin-3mRNA，reduce airway infl ammation and modulate Th1/Th2 balance.

Asthma Galectin-3 ⅠL-4 ⅠFN-γ LCP

437000 湖北省咸寧市中心醫(yī)院兒內(nèi)科（黃娟）

325000 溫州醫(yī)學(xué)院附屬育嬰兒童醫(yī)院兒童呼吸科（羅運春）