陸寧寧， 謝 敏， 程世博， 呂松偉， 黃衛(wèi)華

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1 引言

癌癥是目前威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，腫瘤轉(zhuǎn)移則是癌癥高死亡率的主要原因[1]。在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中，有些細(xì)胞從原位腫瘤病灶脫離進(jìn)入人體外周血循環(huán)系統(tǒng)，并隨著血液循環(huán)進(jìn)入其它組織和器官，生長(zhǎng)成新的腫瘤組織。這種存在于循環(huán)血液中的癌細(xì)胞被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)[2]。2014年Alix-Panabières 等人[3]指出CTCs檢測(cè)可用來解釋腫瘤轉(zhuǎn)移行為、反映腫瘤侵襲性，對(duì)于癌癥治療效果判斷及腫瘤預(yù)測(cè)具有十分重要的意義。

雖然CTCs分選對(duì)癌癥臨床治療具有很大的指導(dǎo)價(jià)值，但其檢測(cè)卻面臨諸多困難與挑戰(zhàn)[3]。首先CTCs數(shù)量十分稀少，每mL血中血細(xì)胞數(shù)量超過109個(gè)，而CTCs卻只有幾個(gè)到幾百個(gè)[2]，這便要求所用檢測(cè)方法能高效準(zhǔn)確地從大量非目標(biāo)細(xì)胞中檢測(cè)出極少的目標(biāo)細(xì)胞；其次，CTCs的抗原表達(dá)存在異質(zhì)性，同一類型的癌細(xì)胞其抗原表達(dá)往往具有差異，甚至同一個(gè)病人中的癌細(xì)胞抗原表達(dá)也不完全相同[4]。因此需發(fā)展高靈敏、高特異性方法，以實(shí)現(xiàn)血液中CTCs的分選及檢測(cè)。

2 CTCs分選策略

近年來，隨著人們對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究及檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，多種CTCs富集、分離及檢測(cè)方法得以涌現(xiàn)(圖1)。按照分離原理，這些方法主要可分為基于物理性質(zhì)分離及基于親和識(shí)別分離兩類[2]。其中，基于物理性質(zhì)分離主要利用癌細(xì)胞與正常血細(xì)胞在尺寸[5,6]、密度[7,8]、變形性[9]及黏附性[10]等方面的差異對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行分離；而基于親和識(shí)別分離則是采用抗體[11 - 13]、核酸適配體[14,15]或E選擇素[16,17]等物質(zhì)識(shí)別癌細(xì)胞表面特定抗原，從而實(shí)現(xiàn)CTCs特異性識(shí)別及分離。

一般情況下，癌細(xì)胞在尺寸上大于血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板等其它成分，因此可根據(jù)細(xì)胞大小不同，采用過濾方式分選CTCs?；谀[瘤細(xì)胞與血細(xì)胞間的尺寸以及變形性差異，Hosokawa等人[5]設(shè)計(jì)了具有尺寸選擇性(8～9 μm) 的微腔陣列微流體裝置，用于全血中癌細(xì)胞的快速分離。對(duì)于添加10～100個(gè)肺癌NCI-H358細(xì)胞的1 mL血液樣品，該裝置的分離效率可達(dá)97%，且回收細(xì)胞的活力約為98%。雖然依靠細(xì)胞尺寸的CTCs分選方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞無損傷且利于后續(xù)檢測(cè)，但容易遺漏該尺寸范圍以外的CTCs，特異性較低。

此外，也可利用CTCs與血細(xì)胞密度的差異對(duì)CTCs進(jìn)行分選[7,8]。由于不同種類細(xì)胞密度不同，可通過離心方式分選細(xì)胞。但由于CTCs尺寸與部分血細(xì)胞尺寸交叉，分選的CTCs可能會(huì)與白細(xì)胞或紅細(xì)胞等共沉積，導(dǎo)致靈敏度降低。為改進(jìn)這一問題，Park等人[8]通過在微珠表面修飾EpCAM抗體，特異性識(shí)別CTCs增加細(xì)胞密度，大大提高了CTCs離心分選效果。

總體說來，基于物理性質(zhì)的CTCs分離方法較為簡(jiǎn)單，能較大程度保持細(xì)胞完整性及活性，且對(duì)不同種類的CTCs均可分離，但此類方法缺乏特異性，易遺失相應(yīng)尺寸及密度以外的腫瘤細(xì)胞。相比之下，基于免疫識(shí)別分離的方法可針對(duì)性分離表達(dá)特定抗原的細(xì)胞，具有更高的特異性。由于CTCs膜表面特異表達(dá)角蛋白(CK)[18]、上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)[19]以及組織有關(guān)標(biāo)志物如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)[20]、前列腺抗原(PSA)[21]、癌胚抗原(CEA)[22]等物質(zhì)，若將識(shí)別上述抗原的抗體或核酸適配體固定在固相基質(zhì)上，則可實(shí)現(xiàn)CTCs特異性分離[23]。

免疫識(shí)別分離方法一般以磁性納米顆粒、微納米基質(zhì)或微流控芯片為載體。磁性納米顆粒良好的磁導(dǎo)向性為CTCs的可控分離提供了便利；而微納米基質(zhì)具有高比表面積和特殊形貌，可增加基質(zhì)表面的抗體負(fù)載量，并通過三維拓?fù)湎嗷プ饔迷黾蛹?xì)胞在基底上的黏附力，提高捕獲效率[23]；微流控芯片技術(shù)將采樣、預(yù)處理、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等功能集成在微芯片上，不但可以省去樣品的前處理步驟，還可通過流體沖洗提高分離純度。在此基礎(chǔ)上將多種策略結(jié)合用于CTCs檢測(cè)，不但可以保留各自優(yōu)勢(shì)，還能發(fā)揮不同基質(zhì)間的協(xié)同作用，進(jìn)一步提高捕獲效率及純度。

2.1 磁分離技術(shù)

納米材料近年來受到了研究者的廣泛關(guān)注。磁性納米顆粒作為納米材料的一種，除具備納米材料的特性外，還具有良好的磁導(dǎo)向性和可操控性，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。目前唯一通過美國(guó)FDA認(rèn)證的CTCs檢測(cè)技術(shù)CellSearch系統(tǒng)，就是利用免疫磁珠富集技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌或前列腺癌CTCs的半自動(dòng)化檢測(cè)，具有較高的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性[24]。

磁性納米顆粒表面經(jīng)修飾改性后，可偶聯(lián)抗體、酶、DNA或RNA等多種生物活性物質(zhì)[25,26]，通過這些生物分子與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離與檢測(cè)[18]。由于磁性納米顆粒具有優(yōu)良的磁富集功能，可大大縮短分離時(shí)間，增強(qiáng)方法靈敏度。此外，修飾了生物活性分子的磁性納米顆粒還可與其它納米顆粒如量子點(diǎn)、金納米顆粒等結(jié)合，構(gòu)成多功能納米探針，更加快速方便地用于生物體系中特定組分的捕獲和分離[19,27]。我們課題組[19]通過層層組裝的方式，在聚苯乙烯/丙烯酰胺共聚納米球表面組裝γ-Fe2O3及水溶性CdTe量子點(diǎn)，并連接anti-EpCAM抗體，構(gòu)建了具備熒光-磁性-生物靶向多個(gè)功能的納米探針，并成功用于乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3的分離。

2.2 基于微納米基質(zhì)分離

納米基質(zhì)因包含納米尺度級(jí)別的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，被廣泛用于組織工程學(xué)及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[28]。納米結(jié)構(gòu)可促進(jìn)細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用，有利于細(xì)胞黏附、遷移、增殖分化及天然細(xì)胞外基質(zhì)形成[29]，這一特征對(duì)少量細(xì)胞的分離分析非常有利。盡管與基于物理性質(zhì)的分離方法相比，基于親和反應(yīng)的CTCs檢測(cè)方法可獲得更高的捕獲效率及特異性，但仍較難實(shí)現(xiàn)高純度、高活力的CTCs分離。若將親和識(shí)別分離與仿生納米基質(zhì)結(jié)合，不但能提高抗體在基質(zhì)表面的負(fù)載量[30]，同時(shí)可減緩細(xì)胞在通道中的運(yùn)行速度，增大與基質(zhì)界面的碰撞幾率，因而可進(jìn)一步改善CTCs分離效果。研究表明納米結(jié)構(gòu)可與細(xì)胞表面的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用，在無捕獲試劑的情況下也可實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的捕獲及分離[31]。因此微納米基質(zhì)為探索制備高效CTCs分離器件提供了新思路。

2.2.1納米柱、納米線及納米纖維在CTCs捕獲裝置中，納米柱、納米線及納米纖維基質(zhì)均可通過多種方式獲得。如利用濕法刻蝕或化學(xué)氣相沉積法可制備納米柱或納米線基質(zhì)[32 - 35]。Wang等人[32]通過濕法刻蝕在硅片表面制備硅納米柱陣列，并在納米柱表面固定anti-EpCAM抗體，用于乳腺癌細(xì)胞MCF-7的分離(圖2A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硅納米柱基質(zhì)對(duì)細(xì)胞的捕獲效率(45%～65%) 幾乎為硅平面基質(zhì)的(4%～14%) 的10倍，并且該裝置對(duì)MCF-7細(xì)胞的捕獲效率隨著硅納米柱長(zhǎng)度增加而提高。Lee等人[35]也構(gòu)建了以石英納米線陣列為基質(zhì)的CTCs分離裝置并用于肺癌細(xì)胞A549的高效分離(圖2B)。這些結(jié)果表明三維拓?fù)渥饔迷诩?xì)胞分離中扮演著十分重要的角色。

與納米柱、納米線的制備方式不同，納米纖維一般通過靜電紡絲技術(shù)制備而成[36 - 38]。Zhang等人[38]以鈦酸四丁酯和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為前體，在硅片表面通過靜電紡絲制備PVP及TiO2的復(fù)合納米纖維，通過煅燒除去聚合物模板，最終形成直徑為100 nm～300 nm 的TiO2納米纖維。對(duì)TiO2納米纖維進(jìn)行硅烷化及抗體修飾后，用于癌癥病人血樣中CTCs捕獲(圖2C)。

2.2.2納米粗糙表面由于CTCs的黏附性較血液中其它細(xì)胞強(qiáng)，所以粗糙界面的構(gòu)建為CTCs高效分離提供了另外一種選擇[31]。與納米柱、納米線及納米纖維相類似，納米粗糙表面因比表面積增加，大大提高細(xì)胞與基質(zhì)表面的接觸幾率，促進(jìn)了CTCs分離。如Sekine等人[30]構(gòu)建的基于導(dǎo)電聚合物聚乙烯二氧噻吩(PEDOT) 的納米粗糙表面可提高細(xì)胞分離效率(圖2D)。他們通過電聚合方法在氧化銦錫(ITO) 表面形成納米尺寸范圍的PEDOT-COOH 納米點(diǎn)，修飾EpCAM抗體后用于癌細(xì)胞分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由于配體-受體、基質(zhì)納米結(jié)構(gòu)-細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的協(xié)同相互作用，具有納米點(diǎn)的粗糙界面對(duì)癌細(xì)胞的捕獲效率為無納米點(diǎn)基質(zhì)的4～5倍。

2.2.3碳納米材料以碳納米管、石墨烯為代表的碳納米材料因具有高比表面積、優(yōu)良的導(dǎo)電性能和良好的生物相容性等特點(diǎn)，成為了生物傳感器、儲(chǔ)能材料、藥物載體以及高分子等領(lǐng)域中的常用材料[23]。

利用碳納米管、氧化石墨烯優(yōu)良的導(dǎo)電性能可構(gòu)建CTCs電化學(xué)傳感器[39,40]。Wu等人[40]以氧化石墨烯為基礎(chǔ)，構(gòu)建了以癌細(xì)胞為對(duì)象的電化學(xué)檢測(cè)裝置(圖2E)。他們?cè)诮?jīng)過預(yù)處理的玻碳電極表面沉積氧化石墨烯并進(jìn)行電化學(xué)還原，連接抗體后與細(xì)胞孵育；在此基礎(chǔ)上，將修飾有量子點(diǎn)的二氧化硅納米顆粒耦聯(lián)抗體，并與固定于電極上的細(xì)胞形成免疫夾心結(jié)構(gòu)，通過方波伏安及熒光成像實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的定量測(cè)定。

2.2.4仿生材料自然粒子如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和花粉，因具有獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)眾多優(yōu)良性能。以這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)的自然粒子為模板，可制備具有相應(yīng)結(jié)構(gòu)的仿生材料[41 - 43]。

利用仿生材料的拓?fù)涮卣骺稍鰪?qiáng)材料與細(xì)胞絲狀偽足間的相互作用，從而提高分離效率。Huang等人[44]以胞吞磁性納米粒子后的巨噬細(xì)胞為模板，在細(xì)胞表面進(jìn)行硅化處理并高溫煅燒，在硅材料表面保持了細(xì)胞形貌。通過在其表面修飾抗體，可獲得具有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、磁性、生物靶向多功能的微米探針并用于癌細(xì)胞分離(圖2F)。盡管仿生材料在CTCs分離中的應(yīng)用還較少，但由于其尺寸、形貌與細(xì)胞表面微觀物質(zhì)更為匹配，在細(xì)胞捕獲及分離中具有更明顯的增強(qiáng)效應(yīng)。因此，發(fā)展新型仿生材料，構(gòu)建更智能化的CTCs傳感器將成為CTCs研究領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向。

圖2 微納米基質(zhì)在CTCs 捕獲中的應(yīng)用.(A) 3D 納米基質(zhì)[32];(B) 石英納米線[35];(C) 靜電紡絲形成的TiO2納米纖維[38];(D) PEDOT納米點(diǎn)[30];(E) 基于石墨烯的電化學(xué)傳感器[40];(F) 通過“細(xì)胞模板”制備的多功能顆粒[44]

綜上所述，納米材料因具有高比表面積，可顯著改善基于物理性質(zhì)分離方法中捕獲效率及純度不夠高等問題。但納米柱、納米線、納米纖維、納米粗糙表面及仿生材料等納米基質(zhì)均要通過一系列微加工技術(shù)才能獲得，因此制備過程較為繁瑣、耗時(shí)，不適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。

2.3 基于微流控芯片的CTCs分離

近年來，微流控芯片裝置因其尺寸小、比表面高、流體可控及高度集成化等特點(diǎn)，已逐漸成為生物醫(yī)學(xué)分析的重要平臺(tái)，并廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)、分選及檢測(cè)等過程[45]。

最早用于制作微流控芯片的材料主要有石英、玻璃及單晶硅片，然而由于具備成本低廉、制備過程簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，一系列有機(jī)聚合物如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚二甲基硅氧烷(PDMS) 和聚碳酸酯(PC) 等也逐漸發(fā)展成為芯片制作的常用材料[46]。

基于微流控芯片的CTCs分離方法通過在芯片通道內(nèi)部修飾可識(shí)別細(xì)胞表面抗原的抗體或核酸適配體，當(dāng)通入含CTCs的樣本時(shí)，CTCs與通道表面捕獲試劑結(jié)合，實(shí)現(xiàn)特異性分離。該法所需樣品量小，無需對(duì)血液樣品進(jìn)行前處理，且流動(dòng)的流體環(huán)境有利于去除非特異性吸附的其它細(xì)胞，從而提高分離純度。

2.3.1基于硅材料的微流控芯片硅材料親水性表面可促進(jìn)細(xì)胞黏附，另外采用微加工技術(shù)可制作具有復(fù)雜及高精度結(jié)構(gòu)的芯片。Nagrath等人[12]通過刻蝕法在硅片表面制備了78000個(gè)呈等邊三角形排列的圓形微柱，并在微柱表面修飾anti-EpCAM抗體，將其用于病人血樣中CTCs分離(圖3A)。當(dāng)流速為1～2 mL/h時(shí)，該裝置能從116個(gè)癌癥病人血樣中檢測(cè)出115個(gè)含CTCs的樣本，分離純度為50%，表明了該裝置的靈敏性、特異性及有效性。另外，Gleghorn等人[47]在硅片表面構(gòu)建八邊形微柱陣列，并通過化學(xué)修飾方法連接抗體用于前列腺癌細(xì)胞的分離(圖3B)。八邊形結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可進(jìn)一步增大細(xì)胞與微柱間的接觸頻率，從而提高分離效率及純度。

雖然硅芯片在CTCs分離中有所應(yīng)用，但卻存在光學(xué)不透明性這一缺點(diǎn)。在芯片中引入玻璃材料，不但能保留硅片易于微加工的特點(diǎn)，還可以解決基質(zhì)不透明的困難?；诖吮尘埃琄im等人[48]構(gòu)建了可對(duì)CTCs進(jìn)行過濾分離的微流控芯片裝置。首先將硅片與玻璃基底鍵合，并對(duì)硅片進(jìn)行化學(xué)機(jī)械拋光及反應(yīng)離子刻蝕等操作形成微腔陣列，在硅片頂部再次鍵合玻璃形成CTCs過濾裝置。然后采用修飾抗體的微珠捕獲靶細(xì)胞并放大細(xì)胞尺寸，便于血樣流經(jīng)芯片時(shí)攔截被捕獲的細(xì)胞，而白細(xì)胞及紅細(xì)胞由于尺寸較小隨流體流動(dòng)而被除去，該法回收率可達(dá)89.7%。由于芯片頂部及底部的玻璃具有良好透光性，分離后的細(xì)胞可進(jìn)一步成像觀察。由此可見，玻璃基質(zhì)材料的引入擴(kuò)大了基于硅材料的微流控芯片在CTCs分選中的應(yīng)用范圍。

2.3.2基于PDMS/玻璃的微流控芯片聚二甲基硅氧烷(PDMS)因具有光透明、化學(xué)惰性、無毒廉價(jià)、易使用、高彈性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微流控芯片領(lǐng)域[45]。而玻璃因具有良好透光性，常作為基底與透氣的聚合物鍵合用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞分離分析過程中可獲得清晰的明場(chǎng)及熒光圖片。

利用PDMS及玻璃作為芯片材料的優(yōu)越性，Stott等人[49]設(shè)計(jì)了含魚骨結(jié)構(gòu)的8通道PDMS芯片，并將之與玻璃基底鍵合，在通道內(nèi)部修飾抗體形成細(xì)胞分離裝置(圖3C)。將含靶細(xì)胞的血液樣品通入芯片時(shí)，魚骨結(jié)構(gòu)大大增加細(xì)胞與基質(zhì)表面的碰撞幾率，進(jìn)一步提高了捕獲效率。借助免疫熒光染色方法及成像設(shè)備可對(duì)捕獲到的細(xì)胞進(jìn)行定性及定量分析。對(duì)于血樣中摻雜的前列腺癌細(xì)胞，該裝置可以實(shí)現(xiàn)91.8%的捕獲效率，純度為14%。除此之外，該芯片還能成功從癌癥病人血樣中分離出CTCs簇，這為追蹤臨床治療效果提供了重要依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，Sheng等人[50]對(duì)芯片中的魚骨結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，他們將魚骨結(jié)構(gòu)中的凹槽寬度由50 μm增加至120 μm時(shí)，分離后的細(xì)胞純度可由61%提高到84%，顯示出了該技術(shù)在臨床應(yīng)用中的潛力。

2.3.3基于熱聚物的微流控芯片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 是一種高度透明的熱塑性聚合物，具有質(zhì)輕、價(jià)廉及易于成型等優(yōu)點(diǎn)，可作為微流體裝置的另一理想基質(zhì)。利用含特定結(jié)構(gòu)的金屬模板作為掩膜，通過對(duì)PMMA進(jìn)行紫外照射，可在其表面獲得含豐富羧基官能團(tuán)的圖案化區(qū)域(圖3D)，并且可通過增加紫外光照射強(qiáng)度獲得更粗糙的表面，進(jìn)而提高表面功能化的有效面積。PMMA基質(zhì)表面存在大量羧基官能團(tuán)為抗體連接提供了有力條件，使基于該物質(zhì)的微流控芯片應(yīng)用于癌細(xì)胞的分離分析成為可能[51,52]。環(huán)烯烴共聚物(COC) 具有與PMMA相似的優(yōu)點(diǎn)，但在紫外照射條件下可產(chǎn)生更多羧基，因此可在其表面連接更多數(shù)量的抗體，進(jìn)一步提高捕獲效率及分離純度[53]。

與單獨(dú)使用免疫磁富集的方法相比，微流控芯片用于CTCs的分選具有如下優(yōu)點(diǎn)：首先可在芯片內(nèi)部設(shè)計(jì)多種結(jié)構(gòu)，通道內(nèi)部結(jié)構(gòu)與細(xì)胞表面微觀結(jié)構(gòu)的三維相互作用有利于提高捕獲效率；其次在反應(yīng)裝置中可以進(jìn)行洗滌，有利于提高分離純度。但由于此類芯片往往對(duì)設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)要求較高，因此芯片制備過程較為繁瑣。

圖3 基于微流控芯片的CTCs分離.(A) 基于硅材料的CTC芯片[12];(B) 含八邊形微柱陣列的微裝置[47];(C) 魚骨形芯片[49];(D)紫外照射后PMMA的表面修飾[51]

2.4 基于微流控芯片平臺(tái)的磁分離技術(shù)

基于微流控芯片的免疫磁分離體系一般以芯片為載體，將表面連接抗體的磁性納米顆粒及含靶細(xì)胞的懸浮液共同通入芯片中，在芯片內(nèi)部實(shí)現(xiàn)混合、捕獲、磁分離及洗滌等步驟。這種微流控芯片及免疫磁分離結(jié)合的方法除了具備免疫識(shí)別及磁分離功能外，還可進(jìn)一步提高反應(yīng)通量及分離純度[54 - 56]。

基于上述原理，Toner等人設(shè)計(jì)了CTCs捕獲平臺(tái)“CTC-iChip”[54,57]。該芯片可分為兩個(gè)部分：首先利用覆蓋有可識(shí)別白細(xì)胞表面抗原的磁珠對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，當(dāng)血樣流經(jīng)微流體腔室第一部分時(shí)，在微流體作用下根據(jù)體積大小除去紅細(xì)胞、血漿及多余磁珠；在芯片第二部分，通過慣性聚焦和磁分離技術(shù)將CTCs和白細(xì)胞分離。這一裝置可使用陽性富集方式將EpCAM陽性表達(dá)的CTCs從病人血中分離，還可采用陰性富集方法將EpCAM表達(dá)較弱或不表達(dá)的CTCs分離。該法分離純度較高，且對(duì)CTCs活性基本無影響，分離后的CTCs可進(jìn)行培養(yǎng)、增殖及后續(xù)基因分析，適用于各種類型CTCs的檢測(cè)。

2.5 基于微流控芯片平臺(tái)的微納米基質(zhì)分離技術(shù)

微流控芯片的集成化優(yōu)勢(shì)為CTCs分離獲得更高靈敏度、分離效率及純度這一目標(biāo)提供了廣闊前景，但仍需發(fā)展新興技術(shù)進(jìn)一步提高上述指標(biāo)，從而獲得數(shù)量更多、純度更高、活性更好的細(xì)胞目標(biāo)群體用于后續(xù)分析。而微納米基質(zhì)可提供高比表面積以促進(jìn)細(xì)胞黏附，有利于少量細(xì)胞的分離分析。近年來，將微納米基質(zhì)與微流控芯片結(jié)合用于CTCs檢測(cè)得到了迅速發(fā)展。

如上文所述，Wang等人[32]構(gòu)建了硅納米柱陣列并成功用于MCF-7細(xì)胞分離，證明了三維拓?fù)湎嗷プ饔迷诩?xì)胞分離中的重要作用。在此基礎(chǔ)上，他們又對(duì)這裝置進(jìn)行了優(yōu)化，通過在硅納米柱基質(zhì)頂部鍵合具有魚骨結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的PDMS芯片，制備了NanoVelcro裝置(圖 4A)，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)的混合作用，提高對(duì)細(xì)胞的分離效果。這一裝置已成功用于癌癥病人血樣的分析[11]。

另外，由于碳納米管、氧化石墨烯比表面積較大，能較大程度提高分子吸附量，因而也有效用于細(xì)胞或生物分子檢測(cè)。Chen等人[58]以碳納米管為基礎(chǔ)，結(jié)合微流控技術(shù)構(gòu)建了細(xì)胞分離裝置(圖 4B)。由于碳納米管間存在縫隙，流體可進(jìn)入微柱內(nèi)部，增加細(xì)胞與捕獲基質(zhì)的有效碰撞，同時(shí)還可以減少流體阻力，降低對(duì)細(xì)胞的損傷。Yu等人[59]將Fe3O4磁性納米顆粒與氧化石墨烯混合，制備了Fe3O4-氧化石墨烯復(fù)合物并連接anti-EpCAM抗體(圖 4C)。在磁場(chǎng)控制下，修飾有抗體的Fe3O4-氧化石墨烯復(fù)合物被固定于含鎳柱陣列的微流控芯片中，當(dāng)含靶細(xì)胞的細(xì)胞懸浮通入芯片時(shí)，該裝置能對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行分離。磁場(chǎng)撤除后，被分離的細(xì)胞可回收。

圖4 納米基質(zhì)結(jié)合微流控芯片用于CTCs檢測(cè).(A)硅納米柱基質(zhì)與微流控芯片的集成[11];(B) PDMS芯片中垂直排列的碳納米管基質(zhì)[58];(C) 修飾氧化石墨烯-Fe3O4復(fù)合物的微柱裝置[59]

將微流控芯片與納米材料相結(jié)合，發(fā)揮兩種技術(shù)在CTCs檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)，有利于快速、高效捕獲血液樣品中少量CTCs。因此，基于微流控芯片和納米技術(shù)的CTCs聯(lián)合檢測(cè)平臺(tái)有望滿足臨床診斷中樣品量少、檢測(cè)通量高、實(shí)時(shí)快速等檢測(cè)需求，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

3 CTCs釋放方法研究進(jìn)展

采用上述系列CTCs分選技術(shù)，可將淹沒于大量血細(xì)胞中的少量癌細(xì)胞富集，從而獲得較高純度的目標(biāo)細(xì)胞群體。但分選后的細(xì)胞若繼續(xù)保留于基質(zhì)上，將不利于后續(xù)操作如細(xì)胞培養(yǎng)、PCR分析等的展開。Yu等人[57]于2014年發(fā)表在《Science》上的研究成果表明，若能將CTCs從捕獲基質(zhì)有效解離并對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)合基因測(cè)序與體外藥敏實(shí)驗(yàn)，將有助于建立基于CTCs的腫瘤個(gè)性化診斷技術(shù)。因此，發(fā)展有效的技術(shù)手段，滿足CTCs高效捕獲的同時(shí)實(shí)現(xiàn)CTCs無損傷釋放，獲取具有高生物活力的CTCs，是當(dāng)前CTCs研究的另一熱點(diǎn)。目前發(fā)展的CTCs釋放方法主要基于酶解[34,60,61]、溫控釋放[33,62,63]、光化學(xué)斷鍵[64,65]、化學(xué)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合[66,67]及電化學(xué)解析[68,69]等原理實(shí)現(xiàn)對(duì)捕獲細(xì)胞的解離。

3.1 酶解釋放

利用酶解原理實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與捕獲基質(zhì)的解離較為簡(jiǎn)單，一般采用胰酶處理[60]或酶切[34,61]等方式。前者通過在捕獲了細(xì)胞的基質(zhì)中加入胰酶并結(jié)合流體作用力對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗脫；后者則較多用于使用核酸適配體的體系，在核酸適配體特異性識(shí)別作用下，靶細(xì)胞可被基質(zhì)捕獲，而限制性內(nèi)切酶或核酸酶的加入可切斷捕獲試劑與基質(zhì)的連接，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞釋放。例如Shen等人[34]將生物素化的核酸適配體引入修飾有親和素的納米搭扣芯片中，實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞的特異性捕獲，當(dāng)往芯片內(nèi)通入核酸內(nèi)切酶時(shí)，>90%的細(xì)胞可從基質(zhì)表面解離，釋放后約80%的細(xì)胞保持良好活力(圖 5A)。

3.2 溫控釋放

溫控釋放一般通過在基質(zhì)中引入具有溫敏性能的材料，利用外界溫度變化調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附與分離。最常用的材料是聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)水凝膠，由于其大分子鏈上同時(shí)具有親水基團(tuán)(酰胺基) 和疏水基團(tuán)(異丙基)，因而具有良好的溫敏性能。PNIPAAm水凝膠通常是在32 ℃發(fā)生體積相變，即其最低臨界溶解溫度(LCST) 一般為32 ℃。當(dāng)溫度低于LCST時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)中高分子鏈上的親水集團(tuán)通過氫鍵與水分子結(jié)合，水凝膠高度溶脹。當(dāng)溫度高于LCST時(shí)，高分子鏈中疏水基團(tuán)間的相互作用起主導(dǎo)作用，凝膠失水收縮[70,71]。隨著親水單體含量增加，水凝膠的LCST也將逐漸提高[72]?；谶@一原理，Li等人[62]構(gòu)建了含PNIPAAm水凝膠的細(xì)胞捕獲及釋放平臺(tái)，通過增加親水單體的含量將PNIPAAm的LCST提高至39 ℃。運(yùn)用生物黏附分子RGD捕獲細(xì)胞，當(dāng)溫度由37 ℃升至41 ℃時(shí)，水凝膠由親水膨脹狀態(tài)變?yōu)槭杷湛s狀態(tài)，在收縮過程中黏附在水凝膠表面的細(xì)胞隨著溶液排出而被釋放。此外，Tseng課題組也將pNIPAAm水凝膠用于細(xì)胞捕獲與釋放系統(tǒng)中(圖5B)，并獲得了良好的細(xì)胞釋放效果[33,63]。

3.3 光控釋放

近年來，光響應(yīng)釋放體系也吸引了研究者的廣泛關(guān)注。相比溫度、pH等內(nèi)在刺激源而言，光作為外在刺激能被精確調(diào)控，有利于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的“定時(shí)、定點(diǎn)”釋放。

在CTCs釋放體系中，光控釋放一般通過在基質(zhì)及捕獲試劑之間連接光敏感性物質(zhì)，在紫外或近紅外光照射下光敏分子發(fā)生斷裂，細(xì)胞被釋放[64,65]。Lee等人[64]在微珠表面連接光敏分子后修飾抗體，將之用于癌細(xì)胞的捕獲及釋放，并獲得了良好的分離效果(圖5C)。

光致斷裂的光敏基團(tuán)主要有芘、硝基芐基類和香豆素類等，其中后兩者更為常用。對(duì)硝基芐基類而言，紫外光和近紅外光都可造成光解反應(yīng)。而香豆素類基團(tuán)由于對(duì)近紅外光具有更高效的雙光子吸收，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有更廣闊的應(yīng)用前景[73]。雖然紫外光響應(yīng)性體系能被精確調(diào)控，可遠(yuǎn)程控制細(xì)胞“定時(shí)、定點(diǎn)”釋放，但存在穿透性差、對(duì)細(xì)胞殺傷性強(qiáng)等缺點(diǎn)。而近紅外光(650～900 nm) 穿透力更強(qiáng)，且對(duì)組織體無害，因而更適用于構(gòu)建CTCs光控釋放體系。

3.4 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合引發(fā)釋放

物質(zhì)的相互競(jìng)爭(zhēng)作用也能用來調(diào)控細(xì)胞的捕獲與釋放，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試劑的添加往往能破壞原本穩(wěn)定的細(xì)胞捕獲體系，因而可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞從基質(zhì)中的解離。例如Liu等人[66]通過在硅納米線上接枝3-丙烯酰胺基苯硼酸聚合物(polyAAPBA)，制備了pH和葡萄糖雙響應(yīng)界面(圖5D)。利用polyAAPBA/唾液酸和polyAAPBA/葡萄糖之間的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用，通過控制pH和葡萄糖濃度，可對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行可逆的捕獲與釋放。苯硼酸與唾液酸在相對(duì)較低的pH值條件下能形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，當(dāng)pH為6.8時(shí)polyAAPBA與細(xì)胞膜表面上的唾液酸結(jié)合，細(xì)胞被捕獲；當(dāng)pH升至7.8時(shí)，polyAAPBA中的部分3-丙烯酰胺基苯硼酸基團(tuán)以四面體陰離子形式存在，在外加葡萄糖的條件下，以四面體陰離子形式存在的polyAAPBA與葡萄糖形成的穩(wěn)定復(fù)合物，替代了polyAAPBA/唾液酸的作用從而將細(xì)胞釋放；當(dāng)pH恢復(fù)至6.8且沒有葡萄糖時(shí)，四面體陰離子形式存在的polyAAPBA脫去羥基并重新與唾液酸結(jié)合，再次恢復(fù)細(xì)胞捕獲功能。

3.5 電化學(xué)解析

電化學(xué)釋放主要利用電化學(xué)活性物質(zhì)在氧化還原過程中引起的鍵斷裂(如Au-S)[68]或體積變化[69]等過程，將細(xì)胞從電化學(xué)傳感器件表面解離。例如Jeon等人[69]利用氧化還原過程中電化學(xué)活性物質(zhì)電荷轉(zhuǎn)移引起的體積變化，設(shè)計(jì)了癌細(xì)胞捕獲及釋放體系(圖 5E)。他們通過電化學(xué)方法在ITO表面沉積生物素-聚吡咯復(fù)合物，利用生物素與親和素的相互作用將抗體固定至電極表面，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞捕獲。在外加電場(chǎng)刺激下，氧化還原反應(yīng)發(fā)生并伴隨電化學(xué)活性物質(zhì)的電荷轉(zhuǎn)移，引起可逆的體積變化，從而改變聚吡咯骨架與生物素之間的反應(yīng)強(qiáng)度，使連接抗體的生物素從聚吡咯骨架上分離，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞釋放。

圖5 釋放被捕獲CTCs 的不同策略.(A) 修飾有核酸適配體的納米搭扣裝置[34];(B) 具有溫敏性質(zhì)的納米搭扣裝置[63];(C) 可分解的微珠及過濾設(shè)備[64];(D) pH和葡萄糖雙響應(yīng)界面[66];(E) 摻雜生物素并修飾anti-EpCAM 抗體的聚吡咯電化學(xué)活性裝置[69]

總之，上述釋放方式因各有優(yōu)勢(shì)得到了充分發(fā)展，但也都存在缺陷及不足。采用胰酶釋放細(xì)胞的方法雖然簡(jiǎn)單、容易操作，但效率低，選擇性也較差，不易于獲得高純度CTCs。通過溫控、光控釋放及電化學(xué)解析雖能對(duì)釋放過程進(jìn)行精確調(diào)控，達(dá)到定時(shí)或定點(diǎn)釋放效果，但卻對(duì)材料要求較為嚴(yán)格。此外，限制性內(nèi)切酶及化學(xué)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合也只能分別適用于含核酸適配體或存在物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)作用的體系，這都極大限制了CTCs釋放體系的快速發(fā)展。除此之外，上述方法在釋放過程中都對(duì)細(xì)胞造成一定損傷，因此需要迫切發(fā)展更溫和、靈敏且選擇性好的CTCs釋放方法。

4 結(jié)論與展望

綜上所述，血液中CTCs因含量稀少且存在異質(zhì)性，給CTCs分離分析帶來了巨大挑戰(zhàn)。盡管以納米技術(shù)、微流控芯片、控制釋放為基礎(chǔ)的CTCs分離純化體系已取得了重要進(jìn)展，但要發(fā)展能真正用于癌癥病人血液樣本檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)CTCs的快速靈敏捕獲、高效無損釋放以及后續(xù)基因分析，當(dāng)前依然面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

首先，CTCs的分離純度仍有待提高。研究表明，使用磁性納米顆粒、微納米基質(zhì)或含特定結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的微流控芯片可獲得理想的分離效率，但CTCs目前的分離純度普遍較低[49,74]。因此通過發(fā)明新材料或發(fā)展新方法，保證CTCs高效捕獲的同時(shí)，采取有效手段提高CTCs的分離純度是當(dāng)前的一個(gè)重要研究方向。其次，CTCs的無損釋放及后續(xù)基因分析也是一個(gè)重要研究課題。當(dāng)前，已有部分CTCs可逆釋放體系取得了可喜進(jìn)展，但釋放過程中存在細(xì)胞損傷及釋放效率較低等問題。因此必須建立溫和的CTCs釋放體系，獲取純度高、活力好的CTCs，方便對(duì)其進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)及再分析。此外CTCs的研究應(yīng)進(jìn)一步深入，將釋放后的CTCs體外培養(yǎng)，研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制并與體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)合，將有助于建立基于CTCs的腫瘤個(gè)性化治療技術(shù)。