李 勇， 林 茜， 逄 濤*， 師君麗， 孔光輝， 沐 雪

(1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南玉溪 653100；2.玉溪師范學(xué)院，云南玉溪 653100)

煙葉揮發(fā)性香氣成分是評價煙草及其制品品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]。這些揮發(fā)性香氣成分主要包括醛酮類化合物、呋喃類化合物、吡啶類化合物、吡嗪類化合物以及部分有機酸等。煙葉中許多揮發(fā)性香味成分可直接進入煙氣，并對煙氣的香氣量、香氣質(zhì)等產(chǎn)生重要影響[2]。左天覺等[3]曾指出，烤煙香氣風(fēng)格的主要差異是致香成分間組成和比例不同而造成的。因此，全面、準(zhǔn)確的定性定量分析煙葉中的揮發(fā)性香氣成分對指導(dǎo)煙葉生產(chǎn)和卷煙科學(xué)配方等方面具有重要的意義。

目前，對不同來源的煙葉樣品的揮發(fā)性香氣成分進行了大量的應(yīng)用研究[4 - 8]，采用的分析方法主要有氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)等。在定性方面，現(xiàn)有的分析方法主要是采用NIST和Wiley標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫以及化合物的保留時間進行化合物定性[9]。這些方法簡單易行，但由于色譜柱無法將所有化合物進行完全分離造成質(zhì)譜圖不純、部分化合物含量太低而其質(zhì)譜掩蓋于質(zhì)譜基質(zhì)離子流中，以及不同化合物具有類似質(zhì)譜圖，因此存在著較大的錯誤定性的風(fēng)險；采用保留時間定性則會由于色譜柱老化或者色譜柱之間的差異造成誤差。在定量分析方面，現(xiàn)有的分析方法主要是對化合物的總離子流色譜圖進行積分[10，11]，然后采用內(nèi)標(biāo)相對定量法進行定量。由于香氣組分眾多，色譜柱無法保證對所有組分的基線分離，因此采用總離子流積分就很難實現(xiàn)化合物的準(zhǔn)確定量。

本研究采用色譜保留指數(shù)[12 - 14]、質(zhì)譜去卷積和峰識別[15，16]、質(zhì)譜庫檢索、標(biāo)樣定性等相結(jié)合的方法進行揮發(fā)性香氣成分的定性，減少了色譜峰重疊、目標(biāo)化合物離子流太弱、以及單一定性方法所帶來的定性錯誤；采用選擇離子檢測的方法對所識別的香氣成分進行定量，減少了峰重疊帶來的定量誤差。最終本研究確定了118個揮發(fā)性香氣成分的定性定量信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

PE Clarus 600氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國，PE公司)；改進型同時蒸餾萃取儀(N-SDE，國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心)；Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士，BUCHI公司)。

二氯甲烷(分析純)；無水硫酸鈉(分析純)。

1.2 樣品與標(biāo)樣

本實驗采用的煙葉樣品為2010年全國100個典型煙區(qū)大面積生產(chǎn)烤煙樣品的等量均勻混合樣。標(biāo)準(zhǔn)樣品包括1-戊烯-3-酮等40種，純度均大于98%。內(nèi)標(biāo)正十七烷，純度大于99%。0#輕質(zhì)柴油和汽油混合物(用于保留指數(shù)計算)購自當(dāng)?shù)丶佑驼尽?/p>

1.3 樣品前處理方法

初烤煙葉去梗后在烘箱中于40 ℃條件下干燥4 h，粉碎過40目篩，密封于4 ℃冰箱保存。揮發(fā)性香氣成分提取采用煙草行業(yè)常用的同時蒸餾萃取法[17，18]。處理的具體步驟參見文獻方法[17]。

1.4 GC-MS條件

色譜分析條件：色譜柱為DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫條件：50 ℃保持1 min，以5 ℃/min的速度升至160 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的速度升至270 ℃，保持6 min；進樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣，柱流量為1.1 mL/min；分流比為20∶1；進樣體積為2 μL。

質(zhì)譜分析條件：傳輸線溫度為230 ℃；溶劑延遲時間為1.9 min；質(zhì)量掃描范圍為m/z35～350；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集速度為5 Hz，典型的烤煙樣品色譜圖見圖1a。

圖1 煙葉香氣成分的總離子流(TIC)色譜圖(a)及部分化合物的提取離子圖(b&c)

2 結(jié)果與討論

2.1 香氣成分質(zhì)譜去卷積

質(zhì)譜去卷積是根據(jù)質(zhì)譜碎片的色譜輪廓將屬于同一化合物的質(zhì)譜碎片歸為一類，從而濾除干擾碎片的一種算法。本實驗以香氣成分中保留時間為2.75 min處色譜峰的質(zhì)譜圖為例，對比分析了香氣成分在質(zhì)譜去卷積前后的譜圖差異和譜庫定性差異(圖2)。從圖2可以看出，經(jīng)質(zhì)譜去卷積后，譜圖明顯較去卷積前干凈。從質(zhì)譜定性結(jié)果看，去卷積前后定性結(jié)果完全不同。去卷積前定性結(jié)果2-戊烯醛，定性參數(shù)中相似性、反相似性和可能性分別只有645、649和7，表明定性結(jié)果明顯不可信。而去卷積后其定性結(jié)果為2-甲基-2-丁烯醛，定性參數(shù)中相似性、反相似性和可能性分別為950、986和93，顯示其定性結(jié)果具有很高的可信度。從質(zhì)譜去卷積前后的質(zhì)譜定性結(jié)果可以看出，去卷積使得質(zhì)譜圖更純凈，因而能獲得更可靠的定性結(jié)果。

圖2 質(zhì)譜去卷積前后質(zhì)譜圖比較

2.2 致香成分的定性分析方法

本實驗采用質(zhì)譜去卷積和譜圖庫檢索、色譜保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗證相結(jié)合的方法進行化合物定性?？紤]到相同保留機理的不同色譜柱、同一色譜柱在不同程序升溫條件、不同柱流量條件下化合物的保留時間均會發(fā)生改變，本文采用正構(gòu)烷烴的線性保留指數(shù)進行輔助定性。依據(jù)程序升溫保留指數(shù)算法[12，13]，將正構(gòu)烷烴(C6-C28)和化合物的保留時間帶入保留指數(shù)計算公式，即可計算出化合物的保留指數(shù)(表1)。

表1 烤煙煙葉揮發(fā)性香氣成分定性鑒定及定量評價結(jié)果

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

Note:tr,retention time;RI:retention index;RI ref.,retention index in references.The references were not listed here but can easily be found in the NIST library.QI,quantitative ion;S,similarity;R,reverse;P,probability;RSD,relative standard deviation;R2,correlation coefficient;#,components verified by standard compounds.

在質(zhì)譜定性方面，由于氣相色譜無法將樣品中所有化學(xué)組分進行基線分離，某一時間點所獲得的質(zhì)譜信息可能來自一個以上的化合物。同時，響應(yīng)較弱的化合物的質(zhì)譜也可能被色譜柱流失或質(zhì)譜干擾離子污染。基于此，本實驗首先采用AMDIS軟件進行質(zhì)譜去卷積和峰識別，將屬于同一化合物的質(zhì)譜信息提取出來，并剔除干擾離子，然后再進行譜圖庫檢索(圖1b、圖1c、圖2b、圖2c)。將相似度和反相似度均大于800的化合物列出，作為初步定性結(jié)果。將初步定性化合物在本實驗中計算出的保留指數(shù)與該化合物的文獻保留指數(shù)(由于每一個化合物的文獻保留指數(shù)對應(yīng)著不同的參考文獻，此處不列出相關(guān)文獻，但相關(guān)文獻信息可以通過NIST 譜圖庫獲得)進行對比，如果兩者之間的差值小于10，則認(rèn)為初步定性結(jié)果比較可靠。最后，對部分有標(biāo)準(zhǔn)化合物的初步定性化合物進行標(biāo)樣定性。即比對這些化合物的保留時間和質(zhì)譜圖是否與標(biāo)準(zhǔn)化合物完全一致。按照這種策略，本方法最終定性了118個揮發(fā)性香氣化合物。

2.3 致香成分的定量分析方法

由于無法或者難以獲得標(biāo)準(zhǔn)化合物，致香成分定量分析采用相對定量的方法。即假設(shè)待分析物在檢測器上的響應(yīng)與內(nèi)標(biāo)物一致，將致香成分的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積相除，獲得相對定量信息。本方法采用AMDIS自動去卷積和峰識別軟件，獲得了色譜分離中化合物相對于共流出(鄰近)化學(xué)組分的特征離子，并將這些離子作為參考定量離子(表1)。使用參考定量離子定量積分，可以有效的降低重疊峰干擾，使色譜積分結(jié)果更為真實準(zhǔn)確(圖1b、圖1c)。將獲得的積分結(jié)果除以該離子在化合物中的響應(yīng)豐度(可從NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫中獲得)，即可獲得該離子的總離子流響應(yīng)強度，進行相對峰面積的定量計算。

2.4 重復(fù)性考察

采用內(nèi)標(biāo)相對定量的分析方法，對7個重復(fù)樣品中所定性的118個化合物進行重復(fù)性考察。從整體上看，有60.2%的化合物的RSD差小于20%，80.5%的化合物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于30%。對同一樣品的7次重復(fù)進樣發(fā)現(xiàn)，95%以上的化合物的進樣重復(fù)性小于10%。這說明部分化合物的重現(xiàn)性較差的原因來自樣品預(yù)處理步驟。從RSD與保留時間的關(guān)系看，在保留時間5 min以前，有88%的化合物RSD大于20%，在保留時間5 min以后，只有20%的化合物RSD大于20%。這可能是由于保留時間小于5 min 的化合物揮發(fā)性較強，同時蒸餾萃取和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮時的細微誤差即可引起測量結(jié)果的較大偏差。因此，在進行提取和濃縮的過程中一定要控制操作的每一個環(huán)節(jié)，確保強揮發(fā)性化合物的準(zhǔn)確測量?；衔锏木唧wRSD值見表1。

2.5 線性響應(yīng)考察

由于無法獲得所有化合物的標(biāo)準(zhǔn)樣品，本方法通過對實際樣品中所定性出的118個化合物在不同樣品重量下的響應(yīng)來考察化合物的線性響應(yīng)情況。由于本方法在正常樣品處理情況下每個樣品重量為20 g，線性考察時分別取5、10、15、20、30、40、60 g樣品進行分析，對所獲得的定量信息進行線性考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在被分析的118個化合物中，有42個化合物的線性相關(guān)系數(shù)(R2)在0.99以上，適合于定量分析；38個化合物R2在0.90以上，比較適合于定量分析；另有38個化合物的R2小于0.90，不適合定量分析。從重復(fù)性考察結(jié)果可知，樣品處理步驟帶來了較大的誤差可能是部分化合物的線性響應(yīng)較差的原因。

3 結(jié)論

本文以烤煙煙葉香氣成分的定性鑒定和定量分析為目的，采用質(zhì)譜去卷積和峰識別、質(zhì)譜庫檢索、色譜保留指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化合物驗證等方法共鑒定出118個烤煙香氣成分。采用AMDIS軟件，選取香氣成分的特征定量離子，保證了定量分析的準(zhǔn)確度。考察了所有被定性化合物的重復(fù)性和響應(yīng)線性。分析了部分化合物重復(fù)性和線性不好的原因，為樣品預(yù)處理方法的改進提供了理論依據(jù)。