劉建德， 徐小琴， 陳 偉， 柏正武

(武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北武漢 430073)

手性化合物的制備、分離與檢測(cè)對(duì)于生命科學(xué)和制藥工業(yè)具有重要的意義[1，2]。目前，以手性固定相(Chiral Stationary Phase，CSP)為基礎(chǔ)的高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是對(duì)映體分離和檢測(cè)的最重要方法[3]，多糖類手性固定相(特別是纖維素和直鏈淀粉類手性固定相)因其優(yōu)越的分離性能在HPLC對(duì)映體拆分中得到最廣泛的應(yīng)用[4，5]。為了擴(kuò)大手性柱的應(yīng)用范圍，一些文獻(xiàn)報(bào)道了雙選擇體(Biselector)CSP的制備及其分離性能[6 - 9]。雖然這些雙選擇體CSP的分離能力一般介于兩個(gè)相應(yīng)單選擇體固定相的之間，但擴(kuò)大了固定相的手性識(shí)別范圍。對(duì)于多糖衍生物類CSP來(lái)說(shuō)，多糖衍生物在固定相上的涂覆量一般不超過(guò)20%(wt%)。如果增加兩種多糖衍生物的共混物在固定相上的涂覆量，能否提高雙選擇體CSP的分離性能，則未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本文分別將纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)，以及淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和淀粉-三(4-甲基苯甲酸酯)進(jìn)行共混，制備了兩種不同涂覆量的雙選擇體CSP，測(cè)試了它們的手性分離性能，并對(duì)其分離特性進(jìn)行了討論。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)，Agilent公司)，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱及二極管陣列檢測(cè)器(DAD)；Nicolet 5DX FT-IR型紅外光譜儀(美國(guó)，尼高力公司)；Vario EL Ⅲ CHNOS型元素分析儀(德國(guó)，Elementar公司)；Alltech 1666型色譜柱填充泵(美國(guó)，Alltech公司)；250×4.6 mm不銹鋼空色譜柱(美國(guó)，熱電公司)。

微晶纖維素(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；淀粉(日本Acros Organics公司)；硅膠，球形平均粒徑7 μm，孔徑1 000 ?(日本Daiso Co.，Ltd.)；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)；3,5-二甲基苯基異氰酸酯(德州綠邦化工有限公司)；4-甲基苯甲酰氯(江蘇磐?；び邢薰?；吡啶：依次用KOH和CaH2回流干燥，重蒸。其他用于制備CSP的試劑均為分析純。

1.2 多糖衍生物的制備

參照文獻(xiàn)中的方法[9]，制備纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)，淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和淀粉-三(4-甲基苯甲酸酯)。這些衍生物的紅外光譜和元素分析結(jié)果與其結(jié)構(gòu)相符合。

1.3 制備手性固定相

3-氨基丙基硅膠由3-氨基丙基三乙氧基硅烷與硅膠于95 ℃下在甲苯中反應(yīng)24 h制得，所得氨丙基硅膠用丙酮抽提12 h[10]。將0.28 g(0.54 mmol葡萄糖重復(fù)單元，下同)纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)和0.33 g(0.54 mmol)纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)置于30 mL DMF中，攪拌使其完全溶解，用蒸除溶劑法將其涂覆于3.00 g 3-氨基丙基硅膠表面，制得CSP1，涂覆量為17%。用同樣的方法，將纖維素-三(4-甲基苯甲酸酯)和纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)以25%的涂覆量涂覆于3-氨基丙基硅膠表面制得CSP2；以淀粉-三(4-甲基苯甲酸酯)及淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)代替兩種纖維素的衍生物，分別制得CSP3和CSP4，其涂覆量分別為17%和25%。

實(shí)驗(yàn)中的手性樣品的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 手性樣品的結(jié)構(gòu)式

1.4 色譜條件

用勻漿法裝填色譜柱。以聯(lián)苯為分析物，正己烷-異丙醇(90∶10，V/V)為流動(dòng)相，檢測(cè)柱效；以1,3,5-三叔丁基苯為分析物，測(cè)死時(shí)間(to)。手性樣品溶液均用乙醇配制(1 mg/mL)，并經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣體積為10L。在所有檢測(cè)中，流動(dòng)相的流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定相手性分離性能的比較

CSP 1～4的柱效分別為27 400、20 000、30 800和34 700N/m。用35種結(jié)構(gòu)不同的手性樣品(圖1)，對(duì)所制備固定相的手性分離性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。以最大分離度表示固定相對(duì)手性化合物的分離性能，表1所列出的是手性樣品在各固定相上與最大分離度相對(duì)應(yīng)的結(jié)果。由表1可知，CSP1和CSP2都識(shí)別了29種手性樣品，手性識(shí)別能力相當(dāng)。CSP1和CSP2分別基線分離了18和16種手性化合物，大多數(shù)手性樣品在CSP1上比在CSP2上的分離度要大一些，只有10種手性樣品呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。所以從整體看，CSP1的分離性能比CSP2要強(qiáng)一些。所以增加兩種纖維素共混物的涂覆量，并未使相應(yīng)固定相的手性分離性能得以提高。CSP3和CSP4分別識(shí)別了26和28種手性樣品，其中有16和19種化合物分別達(dá)到基線分離。所以CSP4比CSP3有更強(qiáng)的手性識(shí)別能力和更好的分離性能。對(duì)于兩種以共混淀粉衍生物為手性選擇體的固定相來(lái)說(shuō)，增加選擇體的涂覆量，固定相的手性識(shí)別能力和分離性能都得到一定程度的提高。綜上所述，在選擇體的涂覆量對(duì)固定相的手性識(shí)別及分離性能影響方面，纖維素衍生物雙選擇體固定相和淀粉衍生物雙選擇體固定相呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。其原因可能是纖維素與淀粉衍生物的高級(jí)結(jié)構(gòu)的不同，導(dǎo)致雙選擇體固定相存在不同的手性凹槽，從而出現(xiàn)不同的手性分離性能[10]。

2.2 流動(dòng)相的組成對(duì)手性識(shí)別的影響

在含混合醇(同體積乙醇和甲醇混合物)流動(dòng)相中，分別有17、17和14種手性化合物的對(duì)映體在CSP1、CSP3和CSP4上分離度最大，明顯多于在含異丙醇及含乙醇的流動(dòng)相中有最大分離度的對(duì)映體，所以含混合醇流動(dòng)相有利于這三種固定相的手性識(shí)別及分離。而CSP2例外，該固定相在上述三種流動(dòng)相中有最大分離度的對(duì)映體分別為10、10和9種，即CSP2在這些流動(dòng)相中的手性識(shí)別能力幾乎相當(dāng)。

表1 纖維素及淀粉衍生物固定相的分離性能比較

(續(xù)表1)

Mobile phase:n-hexane/isopropanol(A1100/0,A295/5,A390/10,A480/20,A570/30,v/v);n-hexane/ethanol(B197/3,B295/5,B390/10,B470/30,B550/50,V/V);n-hexane/[ethanol/methanol(50/50,V/V),C198/2,C295/5,C390/10,C470/30,C550/50,V/V].

在這三種流動(dòng)相中，與CSP1相比CSP2的手性分離性能并沒(méi)有提高，因此在含其它不同結(jié)構(gòu)醇的流動(dòng)相中測(cè)試了CSP2的分離性能(表2)。可以看出，以正己烷/正丁醇、正己烷/異丁醇和正己烷/叔丁醇為流動(dòng)相時(shí)，手性樣品在CSP2上的容量因子(k)大小順序?yàn)椋簁正丁醇

表2 CSP2在含不同醇的流動(dòng)相中的分離結(jié)果

Eluent:A:n-hexane/n-propanol;B:n-hexane/isopropanol;C:n-hexane/n-butanol;D:n-hexane/iso-butanol;E:n-hexane/t-butanol.

3 結(jié)論

分別將兩種纖維素衍生物和兩種直鏈淀粉衍生物進(jìn)行共混，制備了涂覆量為17%和25%的雙選擇體固定相，并研究了流動(dòng)相的組成對(duì)手性分離的影響。對(duì)于直鏈淀粉衍生物雙選擇體固定相，提高衍生物的涂覆量，能提高固定相的分離性能；對(duì)于纖維素衍生物雙選擇體固定相來(lái)說(shuō)，提高衍生物的涂覆量，固定相的分離性能稍有降低。另外，在較高涂覆量的纖維素衍生物雙選擇體固定相上，手性樣品在含叔丁醇、異丁醇和正丁醇流動(dòng)相中的保留因子呈依次減小的趨勢(shì)，一些樣品的對(duì)映體在含叔丁醇或異丁醇的流動(dòng)相中能被更好地分離。