馮 蕾， 馬雅倩， 譚 婷,， 鄢愛平， 郭 嵐， 萬益群*,

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330047；2.南昌大學(xué)分析測試中心，江西南昌 330047)

酪氨酸(Tyr)是人體重要的半必需氨基酸，對羥苯基乳酸(PHPLA)和對羥苯基乙酸(PHPAA)是Tyr的酚酸類代謝產(chǎn)物。研究表明，Tyr的代謝紊亂不僅與氨基酸代謝疾病有關(guān)[1 - 3]，而且與惡性腫瘤有一定的相關(guān)性[4 - 7]。在Tyr及其代謝產(chǎn)物的研究中，以血清中Tyr及其代謝產(chǎn)物的研究報道較多[8 - 10]，而對人體尿液中Tyr及其代謝產(chǎn)物的研究相對較少。因此，探索Tyr及其代謝產(chǎn)物含量的分析新技術(shù)并應(yīng)用于尿液樣品測定，對癌癥的輔助診斷、治療和監(jiān)測具有十分重要的臨床意義。

目前，Tyr、PHPLA和PHPAA的分離測定主要采用高效液相色譜法[10 - 17]。其中，紫外分析法[11，12]的靈敏度較低，不適用于體液中Tyr代謝產(chǎn)物的分析測定；質(zhì)譜分析法[13，14]設(shè)備昂貴難于普及，從而限制了其在Tyr及其代謝產(chǎn)物研究中的應(yīng)用。由于Tyr及其代謝產(chǎn)物具有自體熒光，應(yīng)用高效液相色譜-熒光檢測法分析測定Tyr及其代謝產(chǎn)物的研究已見報道[15 - 17]，而將其應(yīng)用于人體尿液中Tyr、PHPLA和對PHPAA的同時測定尚未見報道?；诖耍疚牟捎霉滔噍腿〖夹g(shù)，結(jié)合超高效液相色譜-熒光檢測法(UPLC-FLD)，建立了健康人和胃癌患者尿液中Tyr、PHPUA和PHPAA的同時分析新方法，并取得了較為滿意的結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)，配有G4220A二元泵、G4226A自動進樣器、G1316C柱溫箱、G1321B熒光檢測器(FLD)和ChemStation B.04.02色譜工作站；pHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)；Milli-QS超純水裝置(美國，Millipore公司)；MS2迷你振蕩器(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司)；TEL-40B低速臺式大容量離心機(上海安亭儀器廠)。Supelco ENVI-18固相萃取小柱(500 mg/3mL)，Clean-Up BCX固相萃取小柱(CUBCX153,500 mg/3mL)，Clean-Screen DAU固相萃取小柱(CSDAU506,500 mg/6mL)，國產(chǎn)717型陰離子交換樹脂(上海爭光樹脂廠)。

Tyr標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%，美國Acros Organics 公司)；PHPAA標(biāo)準(zhǔn)品(98%，日本東京化成工業(yè)株式會社)；PHPLA標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，美國Sigma公司)。甲醇、乙腈和異丙醇(色譜純，美國Tedia公司)；其他試劑均為分析純。分別準(zhǔn)確稱取Tyr、PHPLA、PHPAA標(biāo)準(zhǔn)品0.01250 g于25 mL容量瓶，用1%的甲酸溶解并定容，搖勻，配制成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于冰箱內(nèi)4 ℃保存。使用時用緩沖溶液(50 mmol/L甲酸銨,甲酸調(diào)pH=5.8)稀釋至所需濃度。實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 尿樣的采集與處理

取健康人(n=8,南昌大學(xué)志愿者)和胃癌患者(n=10,南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院)空腹(早晨7～8時)尿液50 mL，采集后的尿樣于常溫下以4 000 r/min離心10 min后分離得上層清液，若不能及時檢測，可置于-20 ℃冰箱保存。

Clean-Screen DAU固相萃取小柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。準(zhǔn)確吸取1.0 mL尿液(甲酸調(diào)pH=3.0)通過已活化的Clean-Screen DAU固相萃取小柱，待尿液基本流出后，靜置10 min，用3 mL超純水淋洗，調(diào)節(jié)流速為每分鐘20滴，淋洗液棄去。用10 mL pH=5.8的甲酸銨-甲酸緩沖液∶甲醇=95∶5(V/V)洗脫，調(diào)節(jié)流速為每分鐘20滴，收集洗脫液于10 mL棕色容量瓶中，過0.22 μm水系濾膜，待測。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18快速分離柱(100×2.1 mm,1.8 μm;美國Agilent公司)；柱溫：25 ℃；流動相：pH=5.8的甲酸銨-甲酸緩沖溶液∶乙腈=95∶5(V/V)；流速：0.20 mL/min；熒光檢測波長：λex=277 nm，λem=316 nm；進樣量：5 μL；采樣時間：15 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇與優(yōu)化

圖1 酪氨酸及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

探討流動相中緩沖溶液pH(甲酸銨-甲酸,50 mmol/L)、有機相比例以及流速對Tyr、PHPLA和PHPAA色譜分離行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH<5.5時，Tyr出峰時間提前，實際樣品測定時存在干擾；當(dāng)pH>6.0時，PHPLA和PHPAA無法完全分離。因此，本實驗選擇pH=5.8的甲酸銨-甲酸(50 mmol/L)緩沖體系。由于人體尿液成分復(fù)雜，Tyr出峰時間太早，易存在干擾，通過實驗探索，選擇有機相為5%乙腈，流速為0.20 mL/min。由圖1可知，在優(yōu)化的色譜條件下，Tyr及其代謝產(chǎn)物的分析時間短，分離效果好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(500 mg/L)，配制成一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在優(yōu)化的色譜條件下測定，以色譜峰面積(A)對濃度(c)進行線性擬合。結(jié)果表明，Tyr、PHPLA和PHPAA的線性范圍分別為0.120～12.00 mg/L、0.060～3.00 mg/L和0.048～4.80 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)在0.9996～0.9998之間，線性關(guān)系較好。三種物質(zhì)的檢出限(S/N=3)均為0.016 mg/L，定量限(S/N=10)均為0.040 mg/L；回歸方程參數(shù)見表1。與已報道的方法[12,15,17 - 19]相比，本方法具有較高的靈敏度(表2)。

2.3 樣品前處理方法選擇

人體尿液基體復(fù)雜，為保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，實驗探討了以下前處理方法：(1)取晨尿4 mL，以10 000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL至10 mL棕色容量瓶，緩沖溶液(甲酸銨-甲酸,50 mmol/L,pH=5.8)定容，過0.22 μm水系濾膜，進樣。(2) ENVI-18固相萃取小柱萃取。ENVI-18依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，尿液(1.0 mL)通過已活化的ENVI-18固相萃取小柱，待基本流出后，靜置10 min，超純水淋洗，pH=5.8的甲酸銨-甲酸緩沖液∶甲醇=95∶5(V/V)洗脫，收集洗脫液(10 mL)，過0.22 μm水系濾膜，進樣。(3) 717型陰離子交換柱分離。尿液(1.0 mL)通過已活化的717型陰離子交換柱，超純水淋洗，緩沖溶液(甲酸銨-甲酸,50 mmol/L,pH=5.8)、甲酸(1%,5%,10%,15%,20%)、碳酸銨(1 g/L,5 g/L)洗脫，收集洗脫液(10 mL)，過0.22 μm水系濾膜，進樣。(4) Clean-Up BCX固相萃取小柱萃取。Clean-Up BCX依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，尿液(1.0 mL,甲酸調(diào)節(jié)pH=3.0,5.0,6.0;氨水調(diào)節(jié)pH=8.0,9.0)通過已活化的Clean-Up BCX固相萃取小柱，待基本流出后，靜置10 min，超純水淋洗，緩沖溶液(甲酸銨-甲酸,50 mmol/L,pH=5.8)洗脫，收集洗脫液(10 mL)，過0.22 μm水系濾膜，進樣。(5) Clean-Screen DAU固相萃取小柱萃取。Clean-Screen DAU依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，尿液(1.0 mL,甲酸調(diào)節(jié)pH=3.0,5.0,6.0)通過已活化的Clean-Screen DAU固相萃取小柱，待基本流出后，靜置10 min，超純水淋洗，pH=5.8的甲酸銨-甲酸緩沖液∶甲醇=95∶5(V/V)洗脫，收集洗脫液(10 mL)，過0.22 μm水系濾膜，進樣。

表1 酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限

表2 方法檢測限的對比

圖2 尿液經(jīng)不同處理方法的色譜圖

實驗結(jié)果顯示，采用離心、稀釋、過膜方式處理的尿樣，雜質(zhì)較多，對色譜柱的損傷較大，且待測物(尤其是PHPAA)的保留時間發(fā)生偏移，影響待測物的分析測定(圖2)。選用ENVI-18固相萃取小柱，雖然可以去除尿液中部分脂肪和蛋白質(zhì)等有機物，但雜質(zhì)扔較多，對Tyr及其代謝產(chǎn)物的分析測定仍有影響。經(jīng)717型陰離子交換柱處理過的樣品，干擾物質(zhì)得到了很好的去除，但由于717陰離子交換柱對Tyr及其代謝產(chǎn)物的保留能力較強，實驗使用了不同強度洗脫劑，待測物的回收率均低于20%。在Clean-Up BCX固相萃取小柱上，調(diào)節(jié)尿液pH(3.0～9.0)，Tyr及其代謝產(chǎn)物被Clean-Up BCX保留均較弱，干擾物去除效果不佳。Clean-Screen DAU固相萃取小柱基質(zhì)表面鍵合了反相基團和苯磺酸離子交換基團，隨著尿液pH的降低，Clean-Screen DAU對Tyr及其代謝產(chǎn)物的保留能力增強，當(dāng)尿液pH=3.0時，經(jīng)Clean-Screen DAU處理的尿樣，有效去除了非極性有機物，同時也消除了無機物及離子型化合物對待測物分析測定的影響，且Tyr及其代謝產(chǎn)物易于洗脫，回收率在86.9%～107.9%之間，效果良好(圖2)。因此，實驗選用Clean-Screen DAU固相萃取小柱對尿液進行前處理。

2.4 方法回收率與精密度

取健康人和胃癌患者尿液，分別添加三個不同水平Tyr、PHPLA和PHPAA進行回收率和精密度實驗，未加標(biāo)尿液和加標(biāo)尿液按照1.2節(jié)進行前處理后，按1.3節(jié)的色譜條件進行測定，每個水平平行實驗6次，結(jié)果見表3、表4，色譜圖如圖3、圖4所示。實驗結(jié)果顯示，健康人和胃癌患者尿液中三種待測物的回收率在95.2%～107.8%和86.9%～107.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別在0.6%～2.8%和0.5%～2.5%之間。以上結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，可用于實際樣品的測定。

表3 健康人尿液加標(biāo)回收結(jié)果(n=6)

表4 胃癌患者尿液加標(biāo)回收結(jié)果(n=6)

圖3 健康人尿液色譜圖

圖4 胃癌病人尿液色譜圖

2.5 樣品測定

應(yīng)用所建立的分析方法，對8個健康人尿液(1～8號由南昌大學(xué)志愿者提供)和10個胃癌患者尿液(9～18號由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)進行分析，結(jié)果如表5所示。由表5可知，與健康人相比，胃癌患者尿液中PHPAA的含量有升高趨勢。

表5 健康人和胃癌患者尿液中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物分析結(jié)果(n=5)

*not detected.

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取，結(jié)合超高效液相色譜-熒光檢測法測定人體尿液中酪氨酸、對羥苯基乳酸和對羥苯基乙酸的分析方法，探討了不同機理下，應(yīng)用固相萃取技術(shù)處理尿液的效果，成功地除去了大量干擾物質(zhì)，結(jié)果令人滿意。三種物質(zhì)線性關(guān)系良好(R2>0.9996)，檢測限均為0.016 mg/L；在三個水平的加標(biāo)回收實驗中，回收率在86.9%～107.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.5%。該方法利用酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的自體熒光特性，無需衍生即可測定，方法快速、靈敏度高、選擇性好，可用于人體尿液中三組分的同時測定。檢測結(jié)果表明，胃癌患者和健康人尿液中酪氨酸及其部分代謝產(chǎn)物的含量有一定差異，為進一步研究酪氨酸及其代謝產(chǎn)物與癌癥的相關(guān)性提供了方法學(xué)參考。