何崇慧， 吳 晶， 王廷海， 楊紅強

(1.中國石油天然氣股份有限公司蘭州化工研究中心，甘肅蘭州 730060；2.蘭州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，甘肅蘭州 730000)

目前用于微流控芯片分析的主要有質(zhì)譜檢測、電化學(xué)檢測和光學(xué)檢測器。其中，使用最多的當屬激光誘導(dǎo)熒光(Laser Induced Fuorescence，LIF)檢測，該方法以其高靈敏度、優(yōu)良的選擇性以及較寬的線性范圍得到了最廣泛的應(yīng)用和發(fā)展[1 - 3]。國外已有很多商品化的小型激光誘導(dǎo)熒光檢測器，但國內(nèi)目前主要由實驗室根據(jù)自己需要自行搭建，大大降低了檢測的成本，節(jié)省了空間，為微流控分析提供了很大的便利，具有很大的應(yīng)用價值[4，5]。在LIF檢測中，氣相激光器和[6]固體激光器[7，8]雖然得到廣泛應(yīng)用，但由于價格昂貴、壽命短以及能耗高，限制了其在芯片微流控分析中的應(yīng)用。發(fā)光二極管(LED)由于具有較長的使用壽命、較高的穩(wěn)定性、較小的體積以及低的成本而成為了一種新型的光源，但也存在一些缺點[9]。另外一種新型的激光光源是激光二極管，它不但價格便宜、體積較小，而且具有較好的光學(xué)性能、更好的穩(wěn)定性和較長的使用壽命。然而，由于技術(shù)所限，激光二極管使用的波長范圍大多限于近紅外區(qū)[10]以及紅外區(qū)范圍[11]，而適合這個范圍的染料相對于綠光波段范圍來說比較少,因此,短波長的激光二極管便得到了迅速的發(fā)展。Melanson等人[12]首先在毛細管電泳檢測中應(yīng)用紫色激光二極管，他們在進行用NDA標記的氨基酸時檢出限可達10 nmol·L-1。Mathies’s課題組也發(fā)明了用400 nm和405 nm激光二極管作為激發(fā)光源的微型電泳檢測裝置[13 - 15]，在檢測用普魯士藍標記的甘氨酸時檢出限可達6 pmol·L-1[15]。

本研究基于低成本的原則，使用一個價格僅為25美元的激光二極管，以及其驅(qū)動電源作為激發(fā)光源、共聚焦光學(xué)結(jié)構(gòu)、光電倍增管作為信號采集裝置，構(gòu)建了一臺小型、經(jīng)濟的激光誘導(dǎo)熒光檢測器，并對檢測器的性能進行了詳細考察，同時對不同激發(fā)波段的染料標記的熒光物質(zhì)進行了檢測，實驗結(jié)果表明整個裝置成本低廉，靈敏度符合需求 。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F 97 Pro熒光分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)；405 nm激光二極管(20 mW,Sanyo)；激光二極管控制電路(深圳市鉑鐳激光設(shè)備有限公司)；CR105-01光電倍增管(PMT)(北京濱松光子技術(shù)股份有限公司)；BF 430 nm二相色鏡和BF 460 nm長通濾光片(沈陽匯博光學(xué)技術(shù)有限公司)；20 X物鏡(數(shù)值孔徑為0.40，北京大悅維佳科技有限公司)；40 X物鏡(數(shù)值孔徑為0.60，重慶麥克爾光學(xué)器材有限公司)；NI-6009數(shù)據(jù)采集卡(美國，美國國家儀器公司)。

氨基酸標準品(西安周鼎國化學(xué)試劑有限公司)；熒光胺、FITC isomer I(Sigma-Aldrich公司(美國))；四硼酸鈉(西安化學(xué)試劑廠)；熒光素鈉(FS，天津廣成化學(xué)試劑有限公司)；羥丙基纖維素((Hydroxypropyl cellulose，HPC，150～400 mpa.s)Bio Basic公司)；丙酮，吡啶，羅丹明，NaOH，濃H2SO4(天津市光復(fù)精細化工研究所)；羅丹明B(R-B)，羅丹明6G(R-6G,浙江溫州市東升化工試劑廠)。

1.2 405 nm激光誘導(dǎo)熒光檢測器的構(gòu)建

圖1 激光誘導(dǎo)熒光檢測器的結(jié)構(gòu)示意圖

本研究中所構(gòu)建的檢測器示意圖如圖1所示，主要由激發(fā)光源、光路結(jié)構(gòu)、信號采集、數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換以及數(shù)據(jù)處理終端即計算機五部分組成。光路采用共聚焦光學(xué)結(jié)構(gòu)，正交光路設(shè)計，光電倍增管作為光電轉(zhuǎn)換器。激光由激光二極管發(fā)出，經(jīng)過透鏡聚焦后垂直射到二向色鏡上并被二向色鏡反射，通過一個20 X聚光收集物鏡到達檢測窗口，在通道上形成一個幾百微米的光斑。芯片微通道中物質(zhì)被激發(fā)光源激發(fā)后產(chǎn)生的熒光通過聚光物鏡，再經(jīng)二相色鏡透射，接著被長通濾光片過濾掉雜散光后被45°平面反射鏡反射到達PMT信號收集窗口，光信號被PMT捕捉并輸出模擬信號，該模擬信號經(jīng)過放大后由一個NI-6009數(shù)據(jù)采集卡(National Instruments,Austin,TX,USA)采集，將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號輸入電腦進行數(shù)據(jù)的處理。數(shù)據(jù)處理采用Labview軟件(National Instruments,Austin,TX,USA)。為了得到更大的信噪比(S/N)，采用平均點數(shù)法獲取數(shù)據(jù)。

1.3 儀器性能表征

分別用20 X顯微物鏡和40 X顯微物鏡作為該檢測器的聚光物鏡，以熒光胺衍生的亮氨酸作為待測物(濃度10 nmol·L-1)，通過對相同條件下不同放大倍數(shù)聚光物鏡對于檢出限以及峰形的影響來進行物鏡放大倍數(shù)對于檢測器性能的表征。通過考察在激發(fā)光源后添加濾光片，同樣以熒光胺衍生的10 nmol·L-1亮氨酸作為待測物質(zhì)進行檢出限的測定，考察了激發(fā)光源單色性對于檢測器性能的影響。用熒光胺衍生的亮氨酸和硼砂溶液作為樣品，在暗室中沒有其它干擾的情況下通過連續(xù)進樣4 500 s，進行儀器穩(wěn)定性的測試。分別穩(wěn)定增益為200 V至800 V，在每一個增益條件下從15 mA到65 mA調(diào)節(jié)光源供電電流大小，考察其對于信噪比的影響。在暗室中，去除其他干擾，以熒光素鈉作為樣品，考察405 nm激光二極管以及473 nm 半導(dǎo)體泵浦激光器對于樣品光漂白作用的區(qū)別。分別以熒光素鈉、羅丹明B、羅丹明6G以及熒光胺衍生的氨基酸，F(xiàn)ITC衍生的氨基酸作為樣品，進行儀器靈敏度和測量方法精密度的考察。

各類化合物的熒光光譜圖在商品化熒光分光光度計上掃描獲得。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器使用范圍廣泛性表征

熒光胺衍生的氨基酸，F(xiàn)ITC衍生的氨基酸以及各種染料的熒光光譜圖如圖2a、b、c所示。同時我們還比較了對于每一種物質(zhì)在其最佳激發(fā)波長和405 nm激發(fā)時熒光強度的不同(圖2d、e、f)，可以看到對于不同的物質(zhì)熒光強度的變化程度均有很大的不同，其中熒光胺衍生的氨基酸在405 nm激發(fā)時熒光強度的損失最小。該組實驗中每一種樣品的濃度均為200 nmol·L-1，熒光分光光度計的增益為650 V。

圖2 熒光胺標記的氨基酸(a)，F(xiàn)ITC標記的氨基酸(b)和各種染料的熒光光譜圖(c)；(d,e,f)分別為上述物質(zhì)在其最佳激發(fā)和405 nm激發(fā)下熒光強度的變化

通過上述實驗結(jié)果可以得到，405 nm激光誘導(dǎo)熒光檢測器可以應(yīng)用于不同波段物質(zhì)的檢測，在測藍綠色染料時，由于不是其最佳激發(fā)波長導(dǎo)致靈敏度夠高，但是對于一些實際樣品的分析以及現(xiàn)場檢測的要求足夠滿足，而且該檢測器能同時對不同波段的物質(zhì)進行檢測提高了檢測的方便性，降低了檢測的成本，體現(xiàn)了該檢測器具有廣泛使用范圍的優(yōu)點。

2.2 儀器對于不同波段物質(zhì)靈敏度表征

圖3 各種樣品的低濃度毛細管電泳分離譜圖

分別以熒光素鈉、羅丹明B、羅丹明6G以及熒光胺衍生的氨基酸，F(xiàn)ITC衍生的氨基酸作為樣品，進行儀器靈敏度和測量方法精密度的考察，各種樣品的低濃度分離譜圖如圖3所示。表1為各種樣品的檢出限，相對標準偏差(RSD)以及線性關(guān)系等，檢出限的測定均采用3倍的信噪比得到。該檢測器檢出限為在毛細管上檢測熒光胺衍生的亮氨酸時得到，為0.02 nmol·L-1。通過比較在芯片上得到的檢出限和毛細管上得到的檢出限，發(fā)現(xiàn)在毛細管上的到的值稍小一些，原因是COC材料相對于石英來說有一定的熒光背景。實驗結(jié)果也表明用熒光胺衍生的氨基酸比用FITC衍生的氨基酸檢出限低，原因為Ex(熒光胺)=404 nm，而Ex(FITC)=493 nm，即對于FITC來說，405 nm顯然不是其最佳激發(fā)波長，羅丹明系列染料和熒光素鈉檢出限稍高的原因與此相同。

通過計算得到用熒光胺衍生的亮氨酸和谷氨酸的遷移時間的相對標準偏差(RSD，n=5)分別為2.56% 和3.70%，對于FITC衍生的亮氨酸和谷氨酸分別為2.19%和1.24%。由此可以看出該方法具有較好的重現(xiàn)性。表1表明了構(gòu)建的405 nm激光誘導(dǎo)熒光檢測器具有較高的靈敏度和較好的重現(xiàn)性。

表1 儀器靈敏度和檢測方法的精密度

Because of the series dye of rhodamine has strong adsorption in the COC chip,so they were not detected in the chip electrophoresis.

通過不同激發(fā)波段下熒光物質(zhì)的檢測靈敏度表征了該檢測器的檢測性能，跟文獻報道的藍色LED[5]對于熒光素鈉的檢出限為0.2 nmol·L-1，綠色LED對于羅丹明B的檢出限為1 μmol·L-1[16]，以及綠色的OLED對羅丹明6G的0.01 μmol·L-1的檢出限[17]相比，可以看出該檢測器除了對于相對應(yīng)的激發(fā)波長即405 nm激發(fā)下的物質(zhì)具有較高的靈敏度之外，對于藍色和綠色染料同樣具有較高的檢測靈敏度，所以該檢測器可以被廣泛的應(yīng)用于現(xiàn)場實時分析以及快速檢測。

2.3 405 nm激光二極管的光斑及強度

圖4 普通白紙初始熒光強度圖(a),405nm激光二極管照射15min后熒光強度圖(b)及普通白紙熒光光斑亮度分布圖(c)。陰影部分為所對應(yīng)毛細管內(nèi)徑大小(75 μm)

一般認為激光二極管的光比較散，光斑面積比較大，所以我們以普通白紙作為考察對象，用實驗中所用的激光二極管進行照射，分別取剛開始照射以及照射15 min以后的圖像來考察光斑面積對于實驗中芯片檢測的影響。從圖4a和4b可以看出來，經(jīng)物鏡匯聚，405 nm激光可匯聚在一個很小的斑點。在照射一段時間后，熒光強度顯著降低，且中心部位的熒光淬滅遠比邊上嚴重，說明中心部位的光強較高。圖4c為光斑亮度的分布圖，從該圖中可以看出，中心部位的大小與毛細管內(nèi)徑相當，只要調(diào)節(jié)得當，激光二極管的能量能得到充分利用。

圖5 增益大小以及光源供電電流大小對信噪比(S/N)的影響

2.4 儀器穩(wěn)定性考察

用熒光胺衍生的亮氨酸和硼砂溶液作為樣品，在暗室中沒有其他干擾的情況下通過連續(xù)進樣4 500 s，進行儀器穩(wěn)定性的測試。結(jié)果表明，在長時間進樣后，對于不同的樣品，其信號基本保持在一條直線上，說明該檢測器對于實驗中用到的各種樣品均具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 光源供電電流和增益大小對于信噪比的影響

確定激光光源供電電流的情況下，可以由調(diào)節(jié)光電倍增管的增益值進行調(diào)整信號放大倍數(shù)，但是光電倍增管的增益值的調(diào)節(jié)也會影響背景噪音值的大小。本研究中以1 μmol·L-1的熒光素鈉作為待測樣品，分別穩(wěn)定增益為150 V至700 V，在每一個增益條件下從15 mA到65 mA調(diào)節(jié)光源供電電流大小，考察其對于信噪比的影響。如圖5所示，在固定光源供電電流時，信噪比隨著增益的增加而增加，當增益為500 V時，信噪比達到最大值，然后開始下降(在某些電流下，當增益增大的時候，信號會超過5 V，而5 V為電泳程序設(shè)置的時候縱坐標的最高值，譜圖中的峰發(fā)生了畸變，不能反映真實性能，所以在計算信噪比的時去掉了那些峰高超過5 V的數(shù)據(jù))。為了得到較大的信噪比以及漂亮的峰形，實驗中選擇300～600 V增益為最佳增值益范圍。同樣，在固定增益值的情況下，信噪比隨著光源供電電流的增加而增加。綜合考慮到激光二極管的壽命，實驗中選擇光源供電電流為45 mA。

2.6 光漂白作用的考察

由于擔心波長較短的405 nm激光產(chǎn)生過強的光漂白作用，所以在暗室中，以200 μmol·L-1的熒光素鈉作為樣品，考察405 nm激光二極管以及473 nm半導(dǎo)體泵浦激光器對于樣品光漂白作用的區(qū)別。從圖6可以看出來，405 nm激光二極管相對于473 nm的激光器對熒光素鈉的光漂白作用沒有本質(zhì)區(qū)別。

2.7 物鏡放大倍數(shù)對儀器性能的影響考察

為了考察物鏡放大倍數(shù)對于檢測器性能的影響，分別用20 X顯微物鏡和40 X顯微物鏡作為該檢測器的聚光物鏡，以熒光胺衍生的亮氨酸作為待測物質(zhì)(濃度為10 nmol·L-1)，通過對相同條件下不同放大倍數(shù)聚光物鏡對于檢出限的影響以及峰形的影響進行物鏡放大倍數(shù)對于檢測器性能影響的表征，如圖7所示，實驗發(fā)現(xiàn)當物鏡從20 X 改為 40 X時，靈敏度增加了幾乎5倍，但考慮到物鏡的工作距離，在實驗中我們選擇20 X作為檢測器聚光物鏡。

圖6 不同激發(fā)光源對于熒光素鈉光漂白作用的考察

圖7 20× 和 40×物鏡下熒光胺衍生的亮氨酸的芯片電泳譜圖

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了405 nm紫色半導(dǎo)體激光誘導(dǎo)熒光檢測器，并對儀器的各種性能進行了表征。結(jié)果表明，該檢測器具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、檢出限低、可實現(xiàn)數(shù)據(jù)的實時輸出等優(yōu)點。并且通過實際樣品的分離實驗，進一步證明了該LIF足以達到所需靈敏度，將其應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)殘等實際樣品的檢測中，具有很大的現(xiàn)實意義和使用價值。