向術平， 孫芳芳， 許國萍， 江 虹*

(1.長江師范學院化學化工學院，重慶 408100；2.渝中區(qū)環(huán)保局，重慶 40400； 3.彭水環(huán)保局，重慶 409699)

頭孢硫脒(CEFA)是我國自行研制并首先應用于臨床的半合成頭孢菌素。CEFA對革蘭陽性菌和部分革蘭陰性桿菌均有良好的抗菌活性，臨床上主要用于敏感菌引起的各種感染，尤其適用于金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、表葡菌和腸球菌等革蘭陽性球菌引起的各種中重度感染的治療。由于抗生素的廣泛使用，細菌與藥物多次反復接觸后敏感性降低，許多常用頭孢菌素類藥物療效減弱，而CEFA因其自身獨特的性質(zhì)在臨床上倍受重視。目前，測定CEFA的方法主要是高效液相色譜法[1 - 4]，也有熒光光度法[5]的報道。高效液相色譜法雖然靈敏度高，但儀器較昂貴不易普及。

本工作在稀NaOH 溶液中，以乙基紫(EV)作探針，用共振瑞利散射(RRS)技術，研究并建立了測定痕量CEFA的新方法，迄今未見文獻報道。方法用于實際藥物及人血液中CEFA含量的測定，樣品加標回收率為 99.5%～101.8%，相對標準偏差(RSD)小于1.2%，結(jié)果滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-2500型熒光分光光度計(日本，日立公司)，測定狹縫2.5 nm；pHS-3C型精密酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司)。

頭孢硫脒標準(CEFA，重慶藥檢所)溶液：儲備液濃度47.26 mg/L，冰箱4 ℃保存，用時稀釋10倍。乙基紫(EV，上?；瘜W試劑公司分裝廠)溶液：1.0×10-4mol/L。NaOH溶液：0.20 mol/L。Tris-HCl緩沖溶液：0.1 mol/L HCl和0.2 mol/L Tris混合，用酸度計調(diào)節(jié)，配成pH=3.0～9.8的系列緩沖溶液。所用試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

于10 mL具塞比色管中，加入一定量的4.73 mg/L CEFA標準溶液，1.0 mL 0.20 mol/L NaOH 溶液和 3.0 mL 1.0×10-4mol/L EV溶液，用二次蒸餾水稀至刻度，搖勻，15 min 后，以λex=λem=220 nm 在熒光分光光度計上進行同步掃描，得RRS光譜，在最大共振散射波長341 nm 處測定體系的RRS強度IRRS和試劑空白的散射強度I0，計算△IRRS=IRRS-I0。

2 結(jié)果與討論

2.1 EV-CEFA的共振瑞利散射光譜

圖1 乙基紫與頭孢硫脒的共振瑞利散射光譜

按實驗方法掃描CEFA標準溶液、EV溶液及CEFA-EV溶液。從圖1可知，CEFA和EV自身的RRS均十分微弱(圖中曲線1和2)，當在CEFA 的稀NaOH 溶液中加入EV后，CEFA結(jié)構(gòu)中的羧酸根離子則與EV以靜電引力和疏水作用力結(jié)合生成離子締合物，使體系的RRS強度顯著增強，其最大共振散射峰位于341 nm，在此波長下，CEFA在一定濃度范圍內(nèi)，隨著其濃度的增加，體系的RRS強度呈線性下降(圖中曲線4～7)，故可用于CEFA 的定量分析。

2.2 反應介質(zhì)及用量的選擇

考察了pH=3.0～9.8 的Tris-HCl緩沖溶液和0.20 mol/L NaOH 溶液對CEFA-EV體系△IRRS的影響。結(jié)果表明：用0.20 mol/L NaOH 溶液1.0 mL 有較好的效果，體系的靈敏度較高。實驗選用1.0 mL 0.20 mol/L NaOH溶液。

2.3 EV溶液濃度的選擇

考察了不同濃度的 EV 溶液對CEFA-EV體系△IRRS的影響。結(jié)果表明：EV濃度在(2.0～3.0)×10-5mol/L 時，體系的△IRRS較大，實驗用1.0×104mol/L EV 溶液3.0 mL。

2.4 試劑加入順序的選擇

考察了EV、CEFA 和 NaOH 溶液在不同加入順序時對體系△IRRS的影響。結(jié)果表明：以實驗方法的加入順序為最佳。

2.5 反應時間

在優(yōu)化條件下，考察了不同反應時間對體系 △IRRS的影響，結(jié)果表明：締合物在 15 min內(nèi)即可形成，至少穩(wěn)定1 h。實驗選在 15 min后測定。

2.6 標準曲線及檢出限

按實驗方法配制標準系列溶液并在熒光光度計上掃描RRS光譜。在測定波長341 nm 下作 △IRRS-c標準曲線。線性回歸方程為:△IRRS=-524.1-1964c(c:mg/L)，相關系數(shù)r=0.9988，線性范圍為0.094～0.70 mg/L，檢出限(3Sb/K)為0.075 mg/L。

2.7 方法的選擇性

在選定條件下，考察了一些常見物質(zhì)對測定 0.473 mg/L CEFA 的影響。結(jié)果表明，相對誤差不大于±5% 時，以下共存物質(zhì)(倍量)不干擾測定：葡萄糖、麥芽糖、D-果糖、D-木糖、L-賴氨酸、L-白氨酸、L-組氨酸、L-色氨酸、H2C2O4(200)；甘氨酸、L-谷氨酸、L-丙氨酸、檸檬酸三鈉、NaCl、KCl(100)；L-亮氨酸、氨基乙酸、D-甘露糖(80)；Na2SO4、K2SO4、Na2S2O3、KNO3、NH4NO3、Mg(NO3)2、Ba(NO3)2、Pb(NO3)2、Sr(NO3)2(50)；NaI、MnSO4、MgSO4、Fe2(SO4)3、CuCl2、CaCl2、SrCl2(20)；DL-蘋果酸、尿素(10)?？梢?，方法具有良好的選擇性。

2.8 樣品分析

2.8.1藥物分析取重慶市慶余堂制藥有限公司注射用CEFA 1支，將內(nèi)容物溶解后移入1 000 mL 容量瓶中，用水稀至刻度，搖勻。取該液0.50 mL 于100 mL 容量瓶中，用水稀至刻度，搖勻，即為CEFA 待測液。取待測液1.0 mL于10 mL 比色管中，按實驗方法加入 NaOH 溶液和EV 溶液，并用水稀至刻度，再按實驗方法測定樣液中 CEFA 的含量，平行6份，同時作加標回收試驗(n=6)，結(jié)果見表1。

2.8.2血液分析取人體血液樣品(重慶涪陵中心醫(yī)院提供)，以4 000 r/min 離心20 min，取上清液1.0 mL，加入 2.0 mL 甲醇，搖勻，離心分離 10 min，將離心液定容至25.0 mL。取該定容液 1.0 mL，用水稀釋至100 mL，即得待測液。取待測液1.0 mL，按實驗方法加入 NaOH溶液和EV溶液，測定血液樣品中CEFA含量，平行測定6份，同時做加標回收試驗，結(jié)果見表1。

表1 樣品分析結(jié)果及回收試驗 (n=6)

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3 結(jié)論

以乙基紫作探針，用共振瑞利散射技術可以測定人體血液和藥物中痕量頭孢硫脒的含量，方法準確、可靠，并有較高靈敏度和選擇性。