張亞楠， 王瑞勇， 田豐收， 陳亞紅*

(1.周口師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,河南周口 466001;2.鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南鄭州 450001)

銅作為一種過渡金屬元素，在自然界中廣泛存在，是維持生物體生命活動的重要物質(zhì)，同時也是人體必需的微量元素之一。然而，當人體中銅攝入過量時會引發(fā)組織中銅貯存留，蓄積在肝臟內(nèi)，如果蓄積在腦部，則可引起神經(jīng)組織病變，同時還會引發(fā)酮中毒，肝狀豆性核變等疾病[1]。因此，準確測定水、食品、藥品等樣品中的痕量Cu(Ⅱ)具有非常重要的意義。

目前，文獻報道的測定痕量Cu(Ⅱ)的方法主要有分光光度法[2]、熒光法[3]、原子發(fā)射光譜法[4]、原子吸收光譜法[5]和電化學(xué)法[6]等。上述方法中，有的方法靈敏度較低，限制了其應(yīng)用；有的方法所用儀器比較昂貴，不宜推廣。酶催化熒光分析法在臨床、藥物、農(nóng)業(yè)、工業(yè)過程檢測中都具有廣泛的應(yīng)用[7]。本文基于在堿性介質(zhì)中，血紅蛋白對H2O2氧化L-酪氨酸體系具有強烈的催化作用，而Cu(Ⅱ)對該熒光體系具有強烈的抑制作用，據(jù)此建立了測定痕量Cu(Ⅱ)的高靈敏的熒光分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

FP-750型熒光光譜儀(日本，分光公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司)。

Cu(Ⅱ)標準溶液：1.0 mg/L。牛血紅蛋白(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)溶液：1.0×10-4mol/L，4 ℃冰箱保存，用時稀釋為1.0×10-5mol/L。L-酪氨酸(上海伯奧生物科技有限公司)溶液：1.0×10-3mol/L，用時稀釋成1.0×10-4mol/L。H2O2：0.1 mol/L，4 ℃冰箱保存，用時稀釋為1.0×10-4mol/L。Tris-HCl緩沖溶液：按不同比例配制pH分別為7.20、7.36、7.66、7.87、8.05、8.20的緩沖溶液。所用其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

在10.0 mL的比色管中，依次加入Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.66) 2.0 mL，L-酪氨酸溶液2.5 mL，不同濃度的Cu(Ⅱ)標準溶液，1.0×10-5mol/L的牛血紅蛋白溶液0.8 mL，1.0×10-3mol/L的H2O20.7 mL，用二次蒸餾水定容，在室溫下反應(yīng)35 min，在激發(fā)波長為316 nm，發(fā)射波長為403 nm，激發(fā)和發(fā)射光譜通帶均為5 nm條件下，測定其熒光強度，計算相對熒光強度△F=F0-F。式中，F(xiàn)0為試劑空白的熒光強度，F(xiàn)為加Cu(Ⅱ)溶液的熒光強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

圖1 不同體系的熒光光譜

如圖1所示，在激發(fā)波長316 nm下，H2O2-L-酪氨酸體系在403 nm處有較強的熒光發(fā)射(曲線2)，當加入牛血紅蛋白后體系熒光強度明顯增強(曲線1)，而加入Cu(Ⅱ)后熒光強度大幅降低(曲線3)，但是體系的最大發(fā)射波長沒有變化，仍在403 nm處。由此可見，Cu(Ⅱ)對牛血紅蛋白催化H2O2氧化L-酪氨酸的反應(yīng)體系具有強烈的抑制作用。

2.2 測定條件的優(yōu)化

2.2.1酸度實驗分別考察了pH為7.20、7.36、7.66、7.87、8.05、8.20的Tris-HCl緩沖溶液對體系相對熒光強度的影響。實驗結(jié)果表明：在pH=7.66的Tris-HCl緩沖溶液中，牛血紅蛋白的催化作用最強，而此時Cu(Ⅱ)的抑制作用也非常明顯，體系基本穩(wěn)定。所以，實驗選擇pH=7.66的Tris-HCl緩沖溶液。

2.2.2L-酪氨酸用量隨著L-酪氨酸用量的增加，反應(yīng)體系的熒光強度逐漸增強，當L-酪氨酸用量為2.5 mL時，體系的相對熒光強度△F最大，但是L-酪氨酸用量太大，體系的相對熒光強度反而降低。因此，實驗選擇L-酪氨酸溶液的用量為2.5 mL。

2.2.3H2O2用量隨著H2O2用量的增加，反應(yīng)體系的熒光強度逐漸增大，當H2O2用量為0.7 mL時，其相對熒光強度△F達到最大，但是，再增加H2O2用量，反應(yīng)體系的相對熒光強度反而降低。因此，實驗選擇H2O2的用量為0.7 mL。

2.2.4血紅蛋白濃度隨著牛血紅蛋白用量的增加，反應(yīng)體系的熒光強度逐漸增強，當牛血紅蛋白的加入量為0.8 mL時，反應(yīng)體系的熒光強度達到最大，但是，再增加牛血紅蛋白的量，其相對熒光強度又會降低。所以，實驗選擇牛血紅蛋白用量為0.8 mL。

2.2.5反應(yīng)時間的影響實驗研究了不同反應(yīng)時間下Cu(Ⅱ)對催化體系的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時間的加長，反應(yīng)速率逐漸減慢，室溫下35 min后體系趨于穩(wěn)定。因此，選取35 min作為體系的反應(yīng)時間。

2.2.6反應(yīng)溫度的影響考察了室溫～55 ℃不同反應(yīng)溫度對體系的影響。溫度升高有利于反應(yīng)迅速達到平衡，但高溫會加速H2O2的分解。因此，選擇室溫作為反應(yīng)溫度。

2.3 分析方法特性

2.4 干擾實驗

2.5 樣品分析

將所取的河流污水過濾澄清后，取100 mL，加入5～10 mL HNO3，在電熱板上加熱消解(不要沸騰)，蒸發(fā)至10 mL左右。加入5 mL HNO3和2 mL HClO4繼續(xù)消解至1 mL左右。取下冷卻，加水溶解殘渣，用水定容至10 mL備用[8]。取適量處理好的樣品按實驗方法進行測定，將上述樣品同時用火焰原子吸收光譜法(FAAS)[8]做對照實驗，結(jié)果見表1。從t-檢驗數(shù)據(jù)可以看出，兩種方法無顯著性差異。

表1 樣品中Cu(Ⅱ)的測定結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

利用Cu(Ⅱ)對牛血紅蛋白模擬酶催化H2O2氧化L-酪氨酸熒光體系的抑制程度，建立了一種測定痕量Cu(Ⅱ)的新方法。該方法操作簡單、室溫即可進行，可為黃河流域的水質(zhì)分析提供重要的參考依據(jù)。