梁海東， 喬有明， 裴海昆， 段中華， 全小龍

(青海大學(xué)分析測(cè)試中心，青海西寧 810016)

酯類是植物和土壤有機(jī)質(zhì)中非常重要的物質(zhì)，而脂肪酸是植物體重要的組成成分之一，在大多數(shù)生物體中含量較高，是生物體酯類生物標(biāo)記物中含量最豐富的。由于每一來(lái)源的脂肪酸均有顯著的特征，所以近年來(lái)將脂肪酸作為生物標(biāo)記物廣泛應(yīng)用于各種研究中[1,2]。

氣相色譜是一種分析速度快、分離效能高、特異性及敏感性高，且能和多種檢測(cè)手段聯(lián)用的分離分析方法[3]，而氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法是迄今為止最有效的分析脂肪酸的方法[4]。由于長(zhǎng)鏈脂肪酸沸點(diǎn)高、在高溫下不易揮發(fā)、檢測(cè)時(shí)柱溫高、脂肪酸難分離，對(duì)脂肪酸定性和定量測(cè)定均有干擾，故采用GC或GC-MS分析脂肪酸的組成時(shí)，必需對(duì)樣品進(jìn)行前處理[5]，即將植物油中的脂肪酸甲酯化衍生轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯(FAME)[6]。用于GC-MS分析的前處理方法有多種，不同的處理方法可能會(huì)導(dǎo)致不同的測(cè)定結(jié)果，所以前處理對(duì)于結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵[7]，目前較為廣泛的是硅烷化法和甲酯化法[8,9]。本文對(duì)硅烷化、HCl-甲醇甲酯化以及BF3-甲醇甲酯化三種脂肪酸提取方法進(jìn)行比較，從可鑒定的脂肪酸種類、回收率、操作簡(jiǎn)易程度和經(jīng)濟(jì)成本等方面進(jìn)行了分析，以期為植物脂肪酸的提取與分析提供方法上的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DSQII GC-MS聯(lián)用儀(美國(guó)，Thermo Fisher Scientific)，配NIST2008 版譜庫(kù)；KQ-400KDB高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHA-C恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)。

肉豆蔻酸(C14∶0)、正十五烷酸(C15∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、十六碳烯酸(順-9)(C16∶1)、珠光脂酸(C17∶0)、硬脂酸(C18∶0)、十八碳烯酸(順-9)(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、十八碳三烯酸(順-6，9，12)(C18∶3)、花生酸(C20∶0)、二十二烷酸(C22∶0)、二十二碳二烯酸(順-13,16)(C22∶2)、二十二碳三烯酸(順-13,16,19)(C22∶3)、二十四碳烯酸(順-15)(C24∶1)標(biāo)準(zhǔn)品，配成混標(biāo)液備用。內(nèi)標(biāo)液：正十五烷酸溶液、正十五烷酸甲酯溶液。KOH，正己烷、HCl、二氯甲烷、N,O -雙三甲基硅基三氟乙酰胺、BF3-甲醇溶液(14%，m/V)均為分析純，甲醇為色譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

植物樣品采集自青海果洛的高寒草甸，混合樣品，室溫下自然風(fēng)干，磨碎，過(guò)100目篩，放置在干燥避光處，用自封袋保存，備用。

1.3 樣品處理

1.3.1硅烷化準(zhǔn)確稱取2.5 g樣品于棕色帶蓋子的小瓶中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)和10 mL二氯甲烷，密封，超聲萃取50 min(每隔10 min搖勻一次)，靜置5 min，取上層清液1.5 mL用0.45 μm濾膜過(guò)濾至2 mL樣品瓶中，加200 μL N,O -雙三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)，常溫下衍生60 min后，進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.2HCl-甲醇甲酯化準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品于棕色帶蓋的小瓶中，加入5 mL飽和KOH-甲醇溶液，搖勻后于75 ℃水浴中皂化10 min，提取液重復(fù)皂化一次，合并提取液，冷卻后加入5 mL 5 mol/L HCl-甲醇溶液，在75 ℃的水浴中甲酯化10 min，冷卻后，分2次加入5 mL正己烷進(jìn)行萃取，將萃取后的正己烷溶液置于帶刻度小試管中，氮吹至約1 mL，過(guò)0.45 μm濾膜后，進(jìn)行GC-MS 分析。

1.3.3BF3-甲醇甲酯化稱取50 mg樣品，用二氯甲烷∶甲醇(2∶1，V/V)提取總的脂類物質(zhì)。取2 mL總提取液，加入到棕色帶蓋子的小瓶中，在緩慢流動(dòng)的氮?dú)庀麓蹈?。干燥后，加?.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL，75 ℃水浴中皂化1 h，冷卻后加入正己烷重復(fù)洗滌，除去中性物質(zhì)，然后用2 mol/L HCl酸化至pH為3，最后用正己烷提取脂肪酸。氮?dú)鈼l件下吹至近干，通過(guò)蒸發(fā)除去正己烷，加入100 μL BF3-甲醇溶液(14%，m/V)，80 ℃的條件下甲酯化30 min后，加入2 mL超純水終止反應(yīng)，加入正己烷萃取。待溶劑蒸發(fā)后重新溶解在0.2 mL正己烷中，經(jīng)0.45 μm濾膜后，用于GC-MS 分析。

1.4 GC-MS條件

色譜條件： DB-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣高純氦(He)，流速1.0 mL/min；程序升溫：柱溫60 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升到180 ℃，4 ℃/min升到230 ℃，保持20 min，以20 ℃/min 升到280 ℃，持續(xù)2 min；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度280 ℃。質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊離子源模式(EI)，電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，掃描方式為SCAN 模式，質(zhì)量掃描范圍m/z40～550，溶劑延遲7 min。

1.5 回收率的測(cè)定

加入混標(biāo)液，分別用HCl-甲醇甲酯化和BF3-甲醇甲酯化方法進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取3次的平均值。硅烷化方法因試劑、條件等可引起色譜柱流失，影響其壽命，因此未進(jìn)行回收率和甲酯化率的測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS總離子流色譜圖

由總離子流色譜圖(TIC)可以看到多個(gè)色譜峰，使用NIST2008 版譜庫(kù)進(jìn)行分析檢索，有效色譜峰數(shù)量為HCl-甲醇甲酯化>BF3-甲醇甲酯化>硅烷化。另外，根據(jù)離子強(qiáng)度值和內(nèi)標(biāo)物，可以初步確定三種前處理方法可檢測(cè)到的脂肪酸濃度為BF3-甲醇甲酯化>HCl-甲醇甲酯化>硅烷化，甲酯化方法間相差不大，但大大高于硅烷化方法。

圖1 硅烷化(A)、BF3-甲醇甲酯化(B)和HCl-甲醇甲酯化的GC-MS總離子流色譜圖

2.2 可鑒定的脂肪酸種類

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)以及與常見(jiàn)的14種標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，GC-MS定性分析表明，三種方法可鑒定的脂肪酸種類有所不同。與標(biāo)準(zhǔn)品一致或檢索后相似度大于80%的脂肪酸，HCl-甲醇甲酯化方法檢測(cè)到的有32種，碳原子數(shù)為C4-C26，飽和脂肪酸20種，不飽和脂肪酸12種；直鏈脂肪酸29種，芳香酸3種。BF3-甲醇甲酯化方法可鑒定的脂肪酸為21種，碳原子數(shù)為C7-C26，飽和脂肪酸14種，不飽和脂肪酸7種；直鏈脂肪酸18種，芳香酸3種。硅烷化方法可鑒定的為13種，碳原子數(shù)為C3-C20，飽和脂肪酸8種，不飽和脂肪酸5種；直鏈脂肪酸11種，芳香酸2種。可見(jiàn)，HCl-甲醇甲酯化方法在鑒定脂肪酸種類上優(yōu)勢(shì)顯著。

2.3 處理方法對(duì)儀器的影響

硅烷化方法對(duì)儀器具有較大的影響，尤其是對(duì)于色譜柱，影響尤其明顯，使用1～2次后色譜柱即造成較嚴(yán)重的固定相流失，兩種甲酯化方法對(duì)于色譜柱都沒(méi)有發(fā)生明顯損害現(xiàn)象，因此，從延長(zhǎng)色譜柱的壽命和保護(hù)儀器的角度，甲酯化應(yīng)予以優(yōu)先考慮，硅烷化方法次之。

2.4 甲酯化方法回收率的比較

由表1可看出，HCl-甲醇甲酯化的回收率大多高于85%，其中7種脂肪酸高于90%，最低的棕櫚酸回收率為54.28%；BF3-甲醇甲酯化的回收率大多高于50%，其中2種脂肪酸高于90%，最低的硬脂酸回收率為22.39%，并進(jìn)一步算得前者正十五烷酸的甲酯化率為88.20%，后者為81.23%。因此從回收率和初步的甲酯化率來(lái)看，HCl-甲醇甲酯化方法的效果更好。

表1 脂肪酸回收率

2.5 甲酯化方法操作比較

HCl-甲醇甲酯化方法操作簡(jiǎn)單、便捷，單位樣品的分析成本較低，1 d可以批量處理12～16個(gè)樣品；BF3-甲醇甲酯化方法耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)操作者的要求高，操作繁瑣，1 d僅可以處理4～8個(gè)樣品，且樣品的分析成本較HCl-甲醇甲酯化高。因此，HCl-甲醇甲酯化方法的優(yōu)勢(shì)是十分明顯的。

2.6 分析與討論

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用HCl-甲醇甲酯化過(guò)程中，加入HCl-甲醇進(jìn)行甲酯化后若溶液呈現(xiàn)堿性則甲酯化失敗，因此必須確定HCl-甲醇加入后呈現(xiàn)酸性，若呈堿性，可適量加大HCl-甲醇的用量。此外，HCl-甲醇甲酯化方法的回收率可以通過(guò)更加精細(xì)合理的操作加以提高，甲酯化率則可以通過(guò)對(duì)皂化過(guò)程的時(shí)間溫度以及甲酯化過(guò)程時(shí)間溫度進(jìn)行優(yōu)化加以提高。

3 結(jié)論

通過(guò)比較硅烷化衍生、HCl-甲醇甲酯化衍生和BF3-甲醇甲酯化衍生三種分析植物樣品中脂肪酸的方法，硅烷化可引起色譜柱固定相流失，影響其壽命，而HCl-甲醇甲酯化、BF3-甲醇甲酯化對(duì)色譜柱影響甚微。HCl-甲醇甲酯化比BF3-甲醇甲酯化和硅烷化識(shí)別的脂肪酸種類多，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，因此GC-MS是理想的植物脂肪酸提取分析方法。