瞿 鵬， 武冠輝， 瞿昊宏， 宋凌霄， 田愛(ài)華， 徐茂田

(1.商丘師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南商丘 476001；2.鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南鄭州 450052；3.商丘市第一高級(jí)中學(xué)，河南商丘 476001)

半導(dǎo)體量子點(diǎn)，如CdSe、CdTe 和PbTe等由于其獨(dú)特的光學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)而引起人們的極大關(guān)注。但是半導(dǎo)體量子點(diǎn)由于常使用鎘等重金屬離子，將在細(xì)胞成像時(shí)引起細(xì)胞死亡及環(huán)境污染。碳納米材料，如碳納米管、富勒烯、石墨烯等在生物傳感和藥物傳遞等方面具有重要的作用[1 - 3]。碳量子點(diǎn)(Carbon Dots,CDs)又稱碳點(diǎn)，是繼半導(dǎo)體量子點(diǎn)后的一種新型熒光納米粒子。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光分子相比，CDs具有相對(duì)高的熒光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性、無(wú)光閃爍、化學(xué)惰性及可調(diào)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，與半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比又具有如下優(yōu)點(diǎn)：好的生物相容性、低毒和水溶性等。這種新型的納米粒子可替代有毒的半導(dǎo)體量子點(diǎn)在生物成像和傳感領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用[4 - 6]。

細(xì)胞內(nèi)的Cu(Ⅱ)在生理學(xué)和病理學(xué)方面起非常重要的作用。它是一系列酶的催化劑，如超氧化物歧化酶、細(xì)胞色素C氧化酶、酪氨酸酶等，細(xì)胞體內(nèi)Cu(Ⅱ)的變化會(huì)導(dǎo)致一些嚴(yán)重的神經(jīng)變性疾病[7,8]。因此，高靈敏、高選擇性檢測(cè)Cu(Ⅱ)具有重要的生物醫(yī)學(xué)價(jià)值。

利用內(nèi)濾光熒光傳感體系可將吸光體的吸收信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)光體的熒光信號(hào)，顯著提高檢測(cè)方法的靈敏度[9 - 11]。但是利用內(nèi)濾效應(yīng)構(gòu)建熒光傳感體系需要吸光體和發(fā)光體兩種光活性物質(zhì)，且吸光體的吸收光譜和發(fā)光體的激發(fā)或發(fā)射光譜有效重疊。而基于內(nèi)濾效應(yīng)的熒光傳感還極少，需要進(jìn)一步拓展。水熱法合成CDs的文獻(xiàn)已有報(bào)道，但是大都存在熒光量子產(chǎn)率較低的缺陷[4,12]。本文以檸檬酸為碳源，聚乙烯亞胺(BPEI)為鈍化劑合成了高熒光量子產(chǎn)率的碳點(diǎn)(BPEI-CDs)。采用紫外-可見(jiàn)、熒光、紅外光譜及原子力顯微鏡等對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征。最后利用低毒性的CDs和硫磺素T(ThT)之間的內(nèi)濾光效應(yīng)測(cè)定了Cu(Ⅱ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-2300型紫外-可見(jiàn)-近紅外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國(guó)，安捷倫科技有限公司)；Agilent AFM-5500原子力顯微鏡(美國(guó)，安捷倫科技有限公司)；Thermo Nicolet 360傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)，熱電尼高力公司)；868型數(shù)字pH計(jì)(西班牙，orion公司)；SIGMA 3K15離心機(jī)(美國(guó)，Sigma公司)；MOTICE-36 T純水儀(上海保爾水處理有限公司)。

檸檬酸(CA)和支鏈聚乙烯亞胺(BPEI，分子量為1 800 Da)(Alfa Aesar化學(xué)有限公司)，ThT(美國(guó)Sigma公司)，Na2HPO4·12H2O(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，KH2PO4(天津市基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水是由MOTICE-36T純水儀制備的純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1有機(jī)物碳化法合成BPEI-CDs在BPEI的存在下，通過(guò)一步法熱解CA制得BPEI包裹的碳點(diǎn)(BPEI-CDs)。具體步驟為：在25 mL燒杯中，將0.5 g的BPEI和1.0 g的CA溶解在10 mL熱水(溫度約50 ℃)中，用合適功率的電熱板加熱，溶液的顏色逐漸從無(wú)色變成淺黃色。約50 min后，大部分水被蒸發(fā)，剩下淺黃色的凝膠。在凝膠燒焦之前，加入1 mL水，繼續(xù)加熱，該過(guò)程重復(fù)10次，最終凝膠的顏色為橙色。然后用水將總體積調(diào)至10 mL。將產(chǎn)物在13 000 r/min下離心30 min，取上清液進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法制備的CDs濃度為0.11 g/mL，量子產(chǎn)率為39.8%(以硫酸奎寧為標(biāo)準(zhǔn))。

1.2.2構(gòu)建BPEI-CDs和ThT的熒光內(nèi)濾光體系測(cè)定Cu(Ⅱ) 向ThT的5.0 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=4)中，加入適量的CDs，研究ThT熒光光譜的變化，然后再加入系列濃度的Cu(Ⅱ)，分析熒光強(qiáng)度的變化。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為420 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為480 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，掃描范圍為400～600 nm。

2 結(jié)果和討論

2.1 表征BPEI-CDs

圖1 1.1×10-5 g/mL碳點(diǎn)在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的發(fā)射光譜

BPEI-CDs的紫外吸收光譜中，于355、245 nm處有兩個(gè)明顯的吸收峰(圖略)。在熒光光譜圖中，它的最大激發(fā)波長(zhǎng)為355 nm時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為455 nm。發(fā)射波長(zhǎng)隨著激發(fā)波長(zhǎng)而變化(圖1)。另外，BPEI-CDs的熒光強(qiáng)度和pH值有關(guān)，在pH=4.0時(shí)熒光最強(qiáng)，但總體變化不大，在較寬的pH范圍內(nèi)呈現(xiàn)很好的熒光穩(wěn)定性。

在紅外圖譜中BPEI-CDs幾乎沒(méi)有CA的特征吸收峰，但是卻顯示了BPEI的特征吸收峰，并且在1 711 cm-1處有酰胺鍵的一個(gè)特征的尖吸收峰(圖2A)。說(shuō)明CA幾乎被完全碳化，而大量的BPEI通過(guò)酰胺鍵包裹在CDs的表面。原子力顯微鏡顯示制備的碳點(diǎn)粒徑分布均勻，且主要在3～6 nm之間(圖2B)。

2.2 基于BPEI-CDs/ThT內(nèi)濾光體系測(cè)定Cu(Ⅱ)

2.2.1構(gòu)建BPEI-CDs和ThT的內(nèi)濾光體系BPEI-CDs的發(fā)射光譜與ThT的激發(fā)和發(fā)射圖譜都有很大程度的重疊(圖3)。當(dāng)BPEI-CDs和ThT彼此靠近時(shí)，ThT將吸收BPEI-CDs的熒光而使ThT的熒光顯著增加。如圖4，BPEI-CDs的熒光很強(qiáng)，而ThT很弱，當(dāng)將BPEI-CDs加入到ThT中時(shí)，ThT的熒光顯著增加并且最大發(fā)射波長(zhǎng)從480 nm藍(lán)移到465 nm，說(shuō)明ThT吸收了BPEI-CDs發(fā)出的熒光。但將Cu(Ⅱ) 加入到BPEI-CDs的5.0 mmol/L PBS(pH=5)中時(shí)，BPEI-CDs的熒光減弱，而將Cu(Ⅱ)加到ThT的5.0 mmol/L PBS(pH=5)中時(shí)，ThT熒光無(wú)任何變化。說(shuō)明Cu(Ⅱ)可猝滅BPEI-CDs的熒光但是對(duì)ThT熒光無(wú)影響。將Cu(Ⅱ)加到BPEI-CDs和ThT體系中，可以看到體系的熒光減弱，這是由于Cu(Ⅱ)對(duì)BPEI-CDs熒光的猝滅，導(dǎo)致ThT從BPEI-CDs吸收的光減少，進(jìn)而發(fā)射強(qiáng)度降低。

2.2.2優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件由于BPEI-CDs的熒光強(qiáng)度和pH有關(guān)。本文考察了pH值從2.0到10.0的(5.0 mmol/L)PBS對(duì)測(cè)定Cu(Ⅱ)的靈敏度的影響。當(dāng)pH=5.0時(shí)，熒光降低值△F(△F=F0-F)最大。所以，該體系PBS的最優(yōu)pH值是5.0。

圖2 (A)CA、BPEI 和BPEI-CDs的紅外圖譜；(B)BPEI-CDs的原子力顯微鏡(AFM)圖

隨著B(niǎo)PEI-CDs濃度的增加，△F逐漸增大，并且在BPEI-CDs濃度為3.0×10-4g/mL時(shí)△F達(dá)到最大值，BPEI-CDs濃度繼續(xù)升高△F反而下降。本實(shí)驗(yàn)中選擇BPEI-CDs的濃度為3.0×10-4g/mL。

2.2.3在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定Cu(Ⅱ) 在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，隨著Cu(Ⅱ)濃度的增加，體系的熒光逐漸減弱(圖5)?！鱂和Cu(Ⅱ)的濃度有良好的線性關(guān)系，線性方程為：△F=8.330+0.2721cCu(Ⅱ)，線性范圍為5.0×10-8～5.0×10-5mol/L，線性相關(guān)系數(shù)R=0.9997，檢測(cè)限(S/N=3)是1.0×10-8mol/L。

圖3 BPEI-CDs 和ThT的熒光光譜圖

圖4 BPEI-CDs、ThT 與 Cu(Ⅱ)的之間的相互作用

2.2.4測(cè)定方法的可靠性考察了相同濃度下，Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Ba2+、Zn2+、Ag+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Hg2+和Pb2+對(duì)Cu(Ⅱ)測(cè)定的干擾。結(jié)果顯示Cu(Ⅱ)所對(duì)應(yīng)的△F要明顯大于其他16種金屬元素，見(jiàn)圖6。說(shuō)明該體系對(duì)測(cè)定Cu(Ⅱ)有很好的選擇性。為了驗(yàn)證方法的實(shí)用性，我們進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示回收率在97.0%～102.5%之間，說(shuō)明該方法用于樣品測(cè)定是準(zhǔn)確、可靠的。

圖5 不同濃度Cu(Ⅱ)存在下BPEI-CDs/ThT體系的熒光光譜圖；內(nèi)插圖是體系的熒光強(qiáng)度與Cu(Ⅱ)濃度的線性關(guān)系圖

圖6 BPEI-CDs/ThT體系測(cè)定Cu(Ⅱ)的選擇性

3 結(jié)論

以檸檬酸為碳源、聚乙烯亞胺為鈍化劑，用水熱法合成了高熒光量子產(chǎn)率的碳點(diǎn)。另外，基于碳點(diǎn)和硫黃素T之間的內(nèi)濾效應(yīng)構(gòu)建了測(cè)定Cu(Ⅱ)的熒光分析新體系，該體系對(duì)Cu(Ⅱ)測(cè)定具有很高的靈敏度和選擇性。