余麗雙， 叢日琳， 林詩(shī)瑤，孫照霞，李 煌，林 埔，褚克丹，徐 偉

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122;2.榮成市中醫(yī)院，山東威海 264300)

片仔癀(Pien Tze Huang)是我國(guó)的傳統(tǒng)名貴中成藥，主要由牛黃、三七、蛇膽、麝香等多種名貴中藥精制而成，具有清熱解毒，涼血化瘀，消腫止痛之功效，可以消除人體內(nèi)的“濕、熱、毒、邪”，達(dá)到祛邪安正、預(yù)防保健的效果。對(duì)于片仔癀的質(zhì)量控制，原標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十八冊(cè)只有兩個(gè)反應(yīng)及三七的薄層色譜鑒別項(xiàng)目[1]。《藥典》記載了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、膽酸、去氧膽酸的薄層色譜鑒別，對(duì)麝香酮制定了氣相色譜的含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。為了更快速、準(zhǔn)確地控制片仔癀的質(zhì)量，有必要建立片仔癀的多成分含量測(cè)定的分析方法。

目前有關(guān)片仔癀多成分含量測(cè)定的報(bào)道僅見液相色譜(LC)法[2 - 4]，尚未見應(yīng)用毛細(xì)管電泳(CE)法分離檢測(cè)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用的CE法具有分析時(shí)間短、進(jìn)樣量小、毛細(xì)管柱便宜且易清洗、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，更值得關(guān)注的是其分離模式多，且易于變換分離分析條件，相比于LC等技術(shù)，CE是罕見的適用于復(fù)雜樣品體系及臨床檢驗(yàn)的分析手段，因此CE可為復(fù)雜中藥及其制劑成分測(cè)定及質(zhì)量控制提供有效的新方法[5 - 8]。本文采用混合膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜(mixMs-MEKC)法分離檢測(cè)片仔癀中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、麝香草酚、人參皂苷Rb1及?；悄懰徕c5種有效成分，為片仔癀的質(zhì)量監(jiān)控和藥理研究提供一種快速、靈敏而低成本的新的分析手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

P/ACETMMDQ型毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)，Beckman公司)，配備二極管陣列檢測(cè)器(DAD)和32 Karat 5.0工作站；未涂層彈性石英毛細(xì)管柱(美國(guó)，Beckman公司，63.6 cm×75 μm i.d，有效長(zhǎng)度52.0 cm)；雷磁pHS-3C型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；XS105型電子分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司)。

三七皂苷R1、麝香草酚及?；悄懰徕c標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品(成都曼斯特生物科技有限公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)和膽酸鈉(SC)(北京百靈威科技有限公司)；乙醇、乙腈、Na2B4O7等試劑為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水由Mili-Q超純水儀制備。

片仔癀片劑(漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、麝香草酚、人參皂苷Rb1及牛磺膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，用甲醇溶解，配成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，使用時(shí)用超純水稀釋成所需濃度即可。將片仔癀片劑研磨成粉，精密稱定干燥粉末0.5 g，用20 mL無(wú)水乙醇超聲提取30 min，靜置過濾，殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并兩次濾液，用氮吹儀濃縮至4.0 mL左右，無(wú)水乙醇溶解并定容至5 mL。進(jìn)樣前需經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。

新毛細(xì)管分別用超純水、0.1 mol/L的HCl 、超純水、0.1 mol/L NaOH溶液、超純水各沖洗20 min。使用過的毛細(xì)管分別以超純水、0.1 mol/L NaOH溶液、超純水和運(yùn)行緩沖液各沖洗5 min即可，兩次進(jìn)樣間用緩沖液沖洗2 min即可。所有溶液在電泳前均用聚乙烯濾膜(0.22 μm)過濾以去除大顆粒雜質(zhì)，并經(jīng)超聲除去氣泡。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳分離條件的優(yōu)化

2.1.1運(yùn)行緩沖液及其pH值的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)先采用10 mmol/L Na2B4O7-20 mmol/L NaH2PO4作為緩沖運(yùn)行液，考察不同pH值(8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)對(duì)5種目標(biāo)化合物的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH為9.0和9.5時(shí)的分離效果均較好?？紤]到配制緩沖溶液的方便性，最終選擇可以達(dá)到同樣分離效果的10 mmol/L的Na2B4O7溶液(pH≈9.2)為運(yùn)行緩沖液。

2.1.2表面活性劑的種類及濃度的優(yōu)化當(dāng)表面活性劑的濃度高于膠束臨界濃度時(shí)，易在水中形成膠束，產(chǎn)生類似色譜固定相的作用。所以表面活性劑的種類和濃度是MEKC條件選擇的關(guān)鍵之一。實(shí)驗(yàn)考察了不同表面活性劑種類和濃度，如SC(70、75、80、85、90 mmol/L)、SDS(20、25、30、50 mmol/L)等，對(duì)5種化合物分離的影響，結(jié)果表明采用單一膠束均無(wú)法完全分離上述5種化合物。

圖1 膽酸鈉(SC)濃度對(duì)5種化合物分離的影響

實(shí)驗(yàn)考察了混合膠束對(duì)分離的影響，發(fā)現(xiàn)采用SC-SDS二元混合膠束可以有效分離片仔癀中的5種化合物。實(shí)驗(yàn)首先優(yōu)化了SC濃度(70、75、80、85、90 mmol/L)對(duì)分離產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，隨著SC濃度的增大，分析物的遷移時(shí)間延長(zhǎng)，分離度逐漸增大；當(dāng)SC濃度大于85 mmol/L時(shí)，人參皂苷Rg1(峰2)和麝香草酚(峰3)的分離度明顯減小，因此，選擇SC的最優(yōu)濃度為85 mmol/L，如圖1。在上述最優(yōu)化SC單一膠束溶液中加入SDS形成二元混合膠束，進(jìn)一步考察SDS濃度(20、25、30、50 mmol/L)對(duì)分離的影響，發(fā)現(xiàn)隨著SDS濃度增加，遷移時(shí)間延長(zhǎng)，分離改善，當(dāng)SDS濃度為30 mmol/L時(shí)，即當(dāng)運(yùn)行緩沖液為10 mmol/L Na2B4O7+85 mmol/L SC+30 mmol/L SDS(pH≈9.2)時(shí)，5種化合物均得到基線分離。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用混合二元膠束分離效果優(yōu)于單一膠束其可能的原理如下：(1)混合二元膠束的增溶效果較單一膠束好，化合物與混合膠束可相互作用的范圍增大，即其分離窗口增大，可能使分離得到改善；(2)各分析物在水相與假固定相混合膠束之間的分配系數(shù)發(fā)生變化，可能改善其分離效果。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品的MEKC分離圖

2.1.3分離電壓及進(jìn)樣時(shí)間的優(yōu)化隨著分離電壓的增大，分離效率增大，但當(dāng)電壓過高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較多的焦耳熱，引起區(qū)帶展寬，使分離效率下降。綜合考慮分離度、分析時(shí)間及峰展寬等因素，選擇25 kV為最佳分離電壓。對(duì)進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間大于10 s(0.5 psi)時(shí)，峰形展寬，故選擇10 s(0.5 psi)為最佳進(jìn)樣時(shí)間。

綜上所述，在運(yùn)行緩沖液為10 mmol/L Na2B4O7+85 mmol/L SC+30 mmol/L SDS(pH≈9.2)，進(jìn)樣時(shí)間為10 s(0.5 psi)，分離電壓為25 kV的最佳條件下，片仔癀中5種有效成分標(biāo)準(zhǔn)混合液的電泳圖見圖 2。5種物質(zhì)在16 min內(nèi)達(dá)到基線分離。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系及檢測(cè)限在上述最優(yōu)條件下，測(cè)定5種化合物在一定濃度范圍內(nèi)的峰面積和遷移時(shí)間，以各成分的濃度(X，μg/mL)對(duì)其峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸。根據(jù)三倍信噪比(S/N=3)測(cè)定各組分的檢測(cè)限。結(jié)果如表1 所示，5種化合物的線性關(guān)系良好。

2.2.2精密度試驗(yàn)在上述最優(yōu)條件下，取一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算各組分的峰面積和遷移時(shí)間，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果顯示該方法的精密度良好，結(jié)果見表1。

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取一定濃度的各組分對(duì)照品溶液，分別于0、2、16、18、24 h考察各組分峰面積的變化(用RSD表示)。結(jié)果表明，除麝香草酚外各組分在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定，三七皂苷R1為3.9%，人參皂苷Rg1為4.77%，人參皂苷Rb1為3.17%。麝香草酚在16 h后穩(wěn)定性較差(RSD>10%)，溶液需要重新配制。

表1 回歸方程、線性范圍、檢測(cè)限和精密度

aWhere theYandXare the peak area and concentration of the analytes(μg/mL),respectively；bThe detection limits corresponding to concentrations giving signal to noise ratio of 3.

圖3 片仔癀樣品的電泳色譜圖

2.3 實(shí)際樣品含量測(cè)定及回收率試驗(yàn)

在最優(yōu)條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定供試品溶液，其電泳譜圖如圖 3所示。由圖3可見，除了麝香草酚由于不穩(wěn)定提取過程損失，其他4種成分均可進(jìn)行定性分析，通過外標(biāo)法測(cè)定片仔癀中各有效成分的含量見表 2。

精密稱定片仔癀樣品粉末，按實(shí)驗(yàn)方法制備供試品溶液，然后取一定濃度的供試品溶液，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2 可見，除了牛黃膽酸鈉由于其共存雜質(zhì)的影響，無(wú)法測(cè)定回收率，其他的回收率在76.1%～112.8%之間，基本上滿足了分析方法的要求，有望為片仔癀的質(zhì)量控制提供有效的新方法。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種同時(shí)測(cè)定片仔癀中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、麝香草酚、人參皂苷Rb1及?；悄懰徕c等5種化合物的混合膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜新方法，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)混合二元膠束的協(xié)同作用可以改善分離效果。結(jié)果表明所建新方法簡(jiǎn)單快速，其線性關(guān)系良好，精密度高，有望為片仔癀的質(zhì)量控制和藥理研究提供有效的新方法。

表2 片仔癀樣品的回收率及含量測(cè)定

aNS：refers to not separated.