尹玉霞，侯麗，王鸞鸞，李海心，鄭雯雯

(山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心；山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)

1 引 言

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)醫(yī)療器械生物相容性的一種簡(jiǎn)便、快速、高敏感性的檢測(cè)方法。因其試驗(yàn)周期短，結(jié)果重復(fù)性好、節(jié)省動(dòng)物等優(yōu)點(diǎn)，被列為醫(yī)療器械生物安全性評(píng)價(jià)中首選試驗(yàn)項(xiàng)目，是評(píng)價(jià)材料毒性的重要指標(biāo)[1]。其中浸提液法是目前應(yīng)用最廣泛的一種細(xì)胞毒性篩查法[2]?；钚蕴坷w維是由有機(jī)纖維先驅(qū)體制得的一種理想的高效吸附材料?；钚蕴坷w維以其特殊的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理吸附特性廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、電子工業(yè)、化工、醫(yī)療衛(wèi)生等各個(gè)領(lǐng)域。目前活性炭纖維在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用主要有制作血液過(guò)濾器、人工肝臟及輔助裝置、人工腎臟、活性炭口罩、防毒面具、活性炭敷料等[3]。在日常的體外細(xì)胞毒性檢測(cè)中，含活性炭類(lèi)產(chǎn)品常常不能得到很好的檢驗(yàn)結(jié)果。由于體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法制訂的目的不是規(guī)定一個(gè)單一的試驗(yàn)方法，而是規(guī)定一個(gè)試驗(yàn)方案，需要在一系列試驗(yàn)步驟中判斷，以選出最合適的試驗(yàn)方法[4]。為準(zhǔn)確客觀的評(píng)價(jià)含活性炭產(chǎn)品的細(xì)胞毒性，本實(shí)驗(yàn)在遵循醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，以活性炭敷料類(lèi)產(chǎn)品為檢測(cè)對(duì)象，設(shè)計(jì)不同的浸提液制備方法，通過(guò)MTT比色法，尋找適合含活性炭產(chǎn)品的浸提方法。

2 材料與方法

2.1 細(xì)胞系

小鼠成纖維細(xì)胞L929購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。原種細(xì)胞解凍后，在試驗(yàn)之前傳代2～3次。細(xì)胞消化后在96孔板上接種100 μL密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液(=1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，維持培養(yǎng)24 h(～1倍周期)，至形成半融合單層用于試驗(yàn)。

2.2 試劑和器具

MTT(Sigma)，溶于不含酚紅的MEM中，濃度為1 mg/mL，溶液采用過(guò)濾器(孔徑≤0.22 μm)經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾法除菌，過(guò)濾后當(dāng)天使用；MEM培養(yǎng)基(Gibco)；胰蛋白酶(Gibco)；新生牛血清(NBCS，四季青)。

倒置顯微鏡(Olympus TH4-200)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan MK3)。

2.3 試驗(yàn)樣品及處理

樣品一：含活性炭的閉合用傷口敷料，來(lái)自科云生醫(yī)科技股份有限公司。

樣品二：含活性炭的陰道填塞敷料，來(lái)自山東朱氏堂醫(yī)療器械有限公司。

對(duì)照樣品：不含活性炭的傷口敷料，來(lái)自科云生醫(yī)科技股份有限公司。

陰性對(duì)照：高密度聚乙烯，購(gòu)自日本Hatano Research Institute。

陽(yáng)性對(duì)照：含有二乙基二硫代氨基甲酸鋅的聚氨酯膜(SPU-ZDEC)，購(gòu)自日本Hatano Research Institute。

2.4 浸提液制備

根據(jù)GB/T16886.12-2005，醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12部分：樣品制備與參照樣品[5]制備浸提液。試驗(yàn)樣品按照除吸收容量外，0.1 g/mL的比例，在37±1 ℃的條件下浸提24±2 h制備浸提液，浸提介質(zhì)分別為含或不含10%NBCS的MEM培養(yǎng)基。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別選取含或不含10%NBCS的MEM培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，按照0.1 g/mL的比例，在37±1 ℃的條件下浸提24±2 h，制備浸提液。

2.5 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)組分為2組： A組用含10%NBCS的MEM培養(yǎng)基作浸提介質(zhì)；B組用不含NBCS的MEM培養(yǎng)基作浸提介質(zhì)，浸提結(jié)束后，加入NBCS至終濃度10%。另外，分別設(shè)相應(yīng)的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，各組設(shè)6平行孔。

2.6 試驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)指標(biāo)

按照GB/T14233.2 MTT法進(jìn)行檢測(cè)并評(píng)價(jià)。為反映浸提液對(duì)細(xì)胞毒性作用的趨勢(shì)，選擇浸提液與細(xì)胞接觸時(shí)間分別為24、48、72 h。

3 結(jié)果

3.1 顯微鏡觀察法：

加樣后24、48、72 h鏡下觀察孔內(nèi)細(xì)胞，可見(jiàn)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好，無(wú)空泡，無(wú)細(xì)胞溶解，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)條梭形或不規(guī)則多邊形，胞漿內(nèi)有離散顆粒，無(wú)細(xì)胞增殖下降。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞多數(shù)固縮呈圓形，無(wú)折光性，數(shù)量基本沒(méi)有增加。顯微鏡觀察法顯示陰性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)不大于1級(jí)，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)為4級(jí)，達(dá)到了有效測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)。各試驗(yàn)組細(xì)胞狀態(tài)有不同程度的損傷及生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象。

3.2 MTT比色法

由表1可以看出，細(xì)胞毒性反應(yīng)陰道填塞(2級(jí))>含炭傷口敷料(2級(jí))>對(duì)照樣品(1級(jí))，隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，含活性炭的兩種樣品的毒性反應(yīng)隨之增大，而對(duì)照樣品的毒性反應(yīng)未發(fā)現(xiàn)明顯變化。用含10%NBCS的MEM培養(yǎng)基作浸提介質(zhì)(A組)的含活性炭樣品，在各時(shí)間段均出現(xiàn)最嚴(yán)重的毒性反應(yīng)。用不含NBCS的MEM培養(yǎng)基作浸提介質(zhì)，浸提結(jié)束后，加入NBCS至終濃度10%(B組)后，細(xì)胞毒性有所減弱。

表1 加樣后不同周期各組相對(duì)存活率(RGR)

4 討論

目前，活性炭類(lèi)產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域，根據(jù)其與人體的接觸類(lèi)型和時(shí)間，涵蓋了一類(lèi)、二類(lèi)、三類(lèi)醫(yī)療器械產(chǎn)品。按照生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的要求，這些醫(yī)療器械產(chǎn)品無(wú)一例外都需要做細(xì)胞毒性試驗(yàn)。針對(duì)細(xì)胞毒性浸提介質(zhì)的選擇，國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[4,6]推薦的有含血清的培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基和生理鹽水等。出于對(duì)活性炭高吸附性的考慮，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不同的浸提液制備方法，通過(guò)顯微鏡觀察法和MTT比色法，尋找適合含活性炭產(chǎn)品的浸提方法。

血清中含有多種細(xì)胞生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)因子，能夠有效促進(jìn)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)繁殖[7]。此外，含血清培養(yǎng)基具有浸提極性和非極性兩種物質(zhì)的能力并近似的模擬體內(nèi)環(huán)境，能夠更好地反映醫(yī)療器械的生物安全風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此，對(duì)大部分醫(yī)療器械產(chǎn)品，我們均采用含血清培養(yǎng)基做浸提介質(zhì)以保證細(xì)胞穩(wěn)步生長(zhǎng)。但是，在用含血清培養(yǎng)基對(duì)活性炭類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行浸提時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，活性炭類(lèi)產(chǎn)品能夠吸附血清蛋白等其他未知營(yíng)養(yǎng)成分，吸附能力隨炭膜的厚度增加而增大。用含血清培養(yǎng)基做浸提介質(zhì)的浸提液培養(yǎng)細(xì)胞，降低了細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成毒性增加，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，我們的結(jié)果驗(yàn)證了這一點(diǎn)。與不含活性炭的對(duì)照樣品比，同一公司產(chǎn)的含活性炭傷口敷料細(xì)胞毒性相對(duì)較大，而炭膜更厚的陰道填塞毒性更大；在存活率上，含血清培養(yǎng)基做浸提介質(zhì)組甚至和無(wú)血清培養(yǎng)基浸提組接近。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了在無(wú)血清培養(yǎng)基浸提的基礎(chǔ)上后加入10%血清，在很大程度上緩解了毒性。雖然細(xì)胞毒性結(jié)果仍為2級(jí)，但是達(dá)到了對(duì)醫(yī)療器械細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)。

本研究對(duì)比分析了浸提介質(zhì)的選擇對(duì)含活性炭敷料類(lèi)產(chǎn)品的體外細(xì)胞毒性的影響，并初步分析了原因，認(rèn)為在實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中，不能千篇一律套用標(biāo)準(zhǔn)的方法，所用浸提介質(zhì)和浸提條件應(yīng)與最終產(chǎn)品的屬性和試驗(yàn)?zāi)康南噙m應(yīng)。因此，在無(wú)血清培養(yǎng)基浸提的基礎(chǔ)上，后加入10%血清更為合理的評(píng)價(jià)含活性炭類(lèi)產(chǎn)品的細(xì)胞毒性。