郭欽鈺，陳逸軒，楊 劍，陳文莉，陳新年

（蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞遷移、侵襲作用的影響

郭欽鈺，陳逸軒，楊 劍，陳文莉，陳新年

（蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

目的 研究蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞遷移、侵襲作用的影響及其機(jī)制。方法 不同濃度蒲公英處理細(xì)胞后，用MTS、Transwell小室、熒光實(shí)時定量PCR等方法分別檢測胃癌BGC823細(xì)胞的增值、遷移、侵襲作用以及基質(zhì)金屬蛋白酶2 （MMP2）基因的表達(dá)。結(jié)果 2.5 mg/ml蒲公英組抑瘤率為11.27%；對照組遷移細(xì)胞數(shù)為362個，2.5 mg/ml蒲公英組遷移細(xì)胞數(shù)為234個（P＜0.05）；對照組侵襲細(xì)胞數(shù)為266個，2.5 mg/ml蒲公英組侵襲細(xì)胞數(shù)為183個（P＜0.05）；熒光實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，2.5 mg/ml蒲公英組胃癌BGC823細(xì)胞MMP2基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)論 蒲公英可抑制胃癌BGC823細(xì)胞生長，使胃癌BGC823細(xì)胞的遷移、侵襲作用減弱，其機(jī)制可能是蒲公英引起MMP2基因表達(dá)下降所致。

蒲公英；胃癌BGC823細(xì)胞；遷移；侵襲

胃癌是嚴(yán)重危脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在惡性腫瘤中占第二位。胃癌傳統(tǒng)的治療手段，如手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療都會給患者帶來一系列不良反應(yīng)及并發(fā)癥。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，中藥無論在早、中期作為手術(shù)、化療以及介入治療的輔助手段，還是在晚期因失去手術(shù)機(jī)會、不能耐受化療或介入治療時作為主要治療手段都顯示出一定的臨床效果。有研究表明，蒲公英可以抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長［1］，蒲公英提取物、蒲公英多糖等均具有一定的防癌、抑癌作用以及抑制腫瘤引起的炎癥反應(yīng)［2］，但是其抗腫瘤機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗研究蒲公英水煎劑對胃癌BGC823細(xì)胞遷移、侵襲作用的影響，為蒲公英在抗腫瘤方面的研究及應(yīng)用提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗藥物

藥用蒲公英購自甘肅省蘭州市眾友藥業(yè)公司，本實(shí)驗所選用的藥用蒲公英由蒲公英全草經(jīng)熱水提取，減壓濃縮后噴霧干燥而成的粉末，獲得粉末是提取前蒲公英總量的15%。實(shí)驗中將蒲公英粉末溶解在RIPM-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，按重量體積比分別配制含1.0 mg/ml、2.5 mg/ml蒲公英的細(xì)胞培養(yǎng)液，配制好后用0.22μm的一次性濾器過濾除菌。

1.2 試劑與材料

胎牛血清、RIPM-1640細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Hyclone公司），0.25%胰蛋白酶（美國Gibico公司），DMSO試劑（美國Sigma公司），懸掛式8.0 μm24孔板Transwell小室、0.22 μm一次性針頭濾器、0.45 μm一次性針頭濾器（美國Millipore公司），Matrigel TM Basement Membrane matrix基質(zhì)膠（美國BD公司），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeScript TM 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TM II試劑盒、瓊脂糖（大連TaKaRa公司），RNA提取試劑Trizol（美國Invitrogen公司），F(xiàn)uGENE 6 Transfection Reagent、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（北京Promega公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌BGC823細(xì)胞由蘭州大學(xué)病理生理研究所提供。將BGC823細(xì)胞置入含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RIPM-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞情況，及時更換培養(yǎng)液。

1.4 用MTS法檢測蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞增殖的影響

胰蛋白酶消化胃癌BGC823細(xì)胞，制得1×105/ml的細(xì)胞懸液，分別種于96孔板中（1×104/孔），將細(xì)胞分為3組，即空白對照組、1.0 mg/ml蒲公英組、2.5 mg/ml蒲公英組，每組平行6個孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出96孔板，置于超凈工作臺上，吸棄96孔板中舊培養(yǎng)液，PBS清洗各孔兩次后，加入無血清培養(yǎng)液，然后每孔滴入MTS 20 μl，37℃孵育4 h。用酶標(biāo)儀在波長490 nm條件下檢測。

1.5 用Transwell小室檢測蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞遷移、侵襲作用的影響

1.5.1 細(xì)胞處理 實(shí)驗前一天，將對照組細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無胎牛血清的RIPM-1640培養(yǎng)液，實(shí)驗組細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含2.5 mg/ml蒲公英的無胎牛血清RIPM-1640培養(yǎng)液，37℃，5% CO2培養(yǎng)。24 h后，以胰蛋白酶消化細(xì)胞，分別制成2×105/ml的細(xì)胞懸液。

總之，在大數(shù)據(jù)時代，新媒體與傳統(tǒng)媒體的融合是媒體發(fā)展的必然過程。只有明確媒體融合的目的，提高媒體工作者的全媒體能力，并對媒體渠道進(jìn)行有效的融合，才能真正促進(jìn)媒體行業(yè)良好高速的發(fā)展。

1.5.2 腫瘤遷移實(shí)驗 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中預(yù)先加入完全培養(yǎng)液（500 μl/孔），將預(yù)處理Transwell小室置于孔中，把已制好的對照組、實(shí)驗組細(xì)胞懸液分別加入Transwell小室的上室（100 μl/孔、2×104/孔）。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。

1.5.3 腫瘤侵襲實(shí)驗 將10%人工基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室上室中，4℃靜置1 h。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中預(yù)先加入完全培養(yǎng)液（500 μl/孔），將鋪好基質(zhì)膠的Transwell小室置于孔中，把已制好的對照組、實(shí)驗組細(xì)胞懸液分別加入Transwell小室的上室（100 μl/孔、2×104/孔）。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。

1.5.4 結(jié)晶紫染色計數(shù) 培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室輕輕取出，輕柔擦去小室上室殘留的細(xì)胞懸液，用結(jié)晶紫對小室膜的下室進(jìn)行染色。染色后鏡檢，每個小室鏡下隨機(jī)選取5個視野，進(jìn)行拍照并計數(shù)。

遷移/侵襲下降率=（對照組遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗組遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)）÷對照組遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 熒光實(shí)時定量PCR

1.6.1 細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 將生長良好的胃癌BGC823細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分為空白對照組（0.0 mg/ml）、1.0 mg/ml蒲公英組、2.5 mg/ml蒲公英組。待細(xì)胞生長到鋪滿70%瓶底時，加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)。24 h后按Trizol總RNA提取試劑盒說明書分別提取3組細(xì)胞總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 熒光實(shí)時定量PCR 根據(jù)GenBank中公布的基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）基因序列（NM_001127891）設(shè)計定量PCR特異引物，F(xiàn)：gatggcatcg ctcagatccg、R：tcaggccaga atgtggccac。采用SYBR Green I*嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時定量PCR，擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。反應(yīng)體系 10 ul：SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）5 ul，正向引物0.5 ul，反向引物0.5 ul，cDNA 1.0ul，ddH2O 3.0 ul。反應(yīng)條件：95℃，2 min，一個循環(huán)；95℃，5 s，60℃，30 s，40個循環(huán)；溶解曲線分析65℃～95℃。每個樣品均設(shè)有3個復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞增殖的影響

MTS實(shí)驗結(jié)果顯示，1.0 mg/ml蒲公英組抑瘤率為-50.76%、

2.5 mg/ml蒲公英組抑瘤率為11.27%，有顯著性差異（P＜0.05），見圖1。

圖1 蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞增殖的影響

2.2 蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞遷移作用的影響

處理后的細(xì)胞經(jīng)Transwell遷移小室培養(yǎng)24 h后，鏡下觀察結(jié)晶紫染色結(jié)果，對照組遷移數(shù)為362個，2.5 mg/ml蒲公英組為234個，有顯著性差異（P＜0.05），見圖2、圖3。

圖2 Transwell小室檢測胃癌BGC823細(xì)胞遷移作用結(jié)果

圖3 蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞遷移作用的影響

2.3 蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞侵襲作用的影響

處理后的細(xì)胞經(jīng)Transwell侵襲小室培養(yǎng)24 h后結(jié)晶紫染色，結(jié)果顯示，對照組侵襲細(xì)胞數(shù)為266個，2.5 mg/ml蒲公英組侵襲細(xì)胞數(shù)為183個，有顯著性差異（P＜0.05），見圖4、圖5。

圖4 Transwell小室檢測胃癌BGC823細(xì)胞侵襲作用結(jié)果

圖5 蒲公英對胃癌BGC823細(xì)胞侵襲作用的影響

2.4 熒光實(shí)時定量PCR結(jié)果

熒光實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，1.0 mg/ml蒲公英組的MMP2相對量為0.82，2.5 mg/ml蒲公英組的MMP2相對量為0.35，有顯著性差異（P＜0.05），見圖6。

圖6 熒光實(shí)時定量PCR結(jié)果

3 討論

近年來中藥在臨床腫瘤治療方面取得了長足進(jìn)步，無論是在增強(qiáng)免疫還是在整體調(diào)節(jié)方面，都顯出其較化療藥物的優(yōu)勢［3］。現(xiàn)代研究表明，蒲公英的藥理活性多樣，具有抗菌消炎、消腫散結(jié)、抗氧化及抗腫瘤等作用。蒲公英主要含有胡蘿卜素類、脂肪酸類、三枯類、香豆素類、黃酮類及酚酸類化合物。其中，發(fā)揮藥理活性的主要成分為黃酮類化合物［4，5］。具有抗腫瘤作用的黃酮類化合物有蘆丁、水飛薊素、柚皮苷和槲皮素等。其抗癌、防癌機(jī)制可能與抑制自由基和致癌因子的產(chǎn)生、抑制腫瘤血管生長以及提高機(jī)體免疫力等有關(guān)［6］。也有研究顯示蒲公英的多糖成分具有很好的抗腫瘤作用，其機(jī)制與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)［7］。胃癌的發(fā)病率及死亡率在惡性腫瘤中位居前列，導(dǎo)致死亡的主要原因是發(fā)生浸潤增生與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移過程中，發(fā)揮功能的大部分是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）［8］，而MMP2基因的表達(dá)調(diào)控在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中起著主要作用［9］。本實(shí)驗選用濃度為2.5 mg/ml蒲公英的細(xì)胞培養(yǎng)液處理胃癌BGC823細(xì)胞24 h后，Transwell小室檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，處理過的胃癌BGC823細(xì)胞遷移及侵襲能力均呈下降趨勢；定量PCR結(jié)果表明，經(jīng)蒲公英處理過的胃癌BGC823細(xì)胞MMP2基因表達(dá)下降，并隨蒲公英濃度的增加而降低。提示蒲公英可抑制胃癌BGC823細(xì)胞的遷移、侵襲作用，其機(jī)制可能與蒲公英下調(diào)MMP2基因表達(dá)有關(guān)。作為一種無毒且具有多種活性的抗腫瘤藥物，蒲公英極具開發(fā)潛力，但其是否能作為治療腫瘤的臨床藥物，還需進(jìn)行深入、系統(tǒng)的研究。

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1671-1246（2015）09-0142-03