于 靜， 顧青青， 繆瀟瑤， 安 叡， 尤麗莎， 王新宏

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海　201203）

海螵蛸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

于 靜， 顧青青， 繆瀟瑤， 安 叡， 尤麗莎， 王新宏*

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203）

目的 建立海螵蛸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 對(duì)浙江、山東、江蘇、福建、廣東、廣西、云南、海南和遼寧省產(chǎn)的30批海螵蛸進(jìn)行了顯微鑒別并對(duì)其碳酸鈣含有量、5種重金屬［銅（Cu）、砷（As）、鎘（Cd）、鉛（Pb）和汞（Hg）］和水分、總灰分及酸不溶性灰分進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果 碳酸鈣在0.050 1～0.160 1 g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r= 0.999 5）；平均加樣回收率為100.9%，RSD 0.24%（n=9）；精密度試驗(yàn)RSD 0.10%（n=5）；重復(fù)性試驗(yàn)RSD 0.13%（n=5）；穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD 0.26%（n=5）。不同產(chǎn)地海螵蛸的碳酸鈣含有量范圍為83.20%～95.42%，平均值為90.09%；水分測(cè)定結(jié)果為0.92%～2.71%，平均值為1.79%；總灰分結(jié)果為83.50%～95.87%，平均值為90.66%；酸不溶性灰分結(jié)果為0.01%～0.34%，平均值為0.17%。2個(gè)樣本含銅量超過(guò)限度、9個(gè)樣本的含鎘量超過(guò)限度。結(jié)論 規(guī)定碳酸鈣含有量不得少于86.0%，可使93%的樣本被覆蓋在合格范圍內(nèi)；海螵蛸水分不得高于2.5%，可使96%的樣本被覆蓋在合格范圍內(nèi)。

海螵蛸；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；碳酸鈣；水分

海螵蛸為烏賊科動(dòng)物無(wú)針烏賊Sepiella maindroni de Rochebrune或金烏賊Sepia esculenta Hoyle的干燥骨狀內(nèi)殼，具有收斂止血、澀精止帶、制酸止痛、收濕斂瘡等作用［1］。早在公元前三世紀(jì)左右，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已有烏賊骨作丸飲以鮑魚(yú)汁治血枯的記載［2］。海螵蛸主要成分為碳酸鈣，尚含多糖［3］、氨基酸［4］、殼角質(zhì)、黏液質(zhì)和多種微量元素。現(xiàn)代藥理研究表明，海螵蛸所含的碳酸鈣能中和胃酸，改變胃內(nèi)容物pH，降低胃蛋白酶活性，促進(jìn)潰瘍面愈合，緩解嘔酸及燒心癥狀，又可促進(jìn)潰瘍面炎癥吸收，阻止出血，減輕局部疼痛。林乾良等［5］證明海螵蛸收斂作用源于富含的鈣，方爾笠等［6］發(fā)現(xiàn)海螵蛸具有防治胃潰瘍作用。此外，海螵蛸對(duì)婦科病［7］、眼?。?］、哮喘［9］和骨科?。?0-12］等也有較好療效。在《中國(guó)藥典》2010年版一部海螵蛸項(xiàng)下，顯微鑒別簡(jiǎn)單，無(wú)水分、灰分、酸不溶性灰分和重金屬測(cè)定等內(nèi)容［1］，難以達(dá)到有效控制藥材質(zhì)量的目的。為此，本實(shí)驗(yàn)收集不同產(chǎn)地海螵蛸樣品，開(kāi)展了相關(guān)研究，旨在為提升海螵蛸藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1　材料

1.1儀器7500Ce電感耦合等離子質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Mars-xp微波消解儀（美國(guó)CEM公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；Zentrifugen D78532 Tuffingen離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；SZJX箱式電爐（上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科技有限公司）；電子天平（BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；鐵架臺(tái)；滴定管（50 mL）；錐形瓶（250 mL）等。

1.2試劑 乙二胺四乙酸二鈉（批號(hào)F20100223）、濃鹽酸（批號(hào)T20100426）、氫氧化鉀（批號(hào)T20090224）、氨水（批號(hào)20130606）、鈣黃綠素指示劑（批號(hào)20130424）、甲基紅（批號(hào)F20071107）均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鉻黑T（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20110330）；氧化鋅（工作基準(zhǔn)物質(zhì)，天津市化學(xué)試劑研究所）；碳酸鈣（上海泗聯(lián)化工廠有限公司，批號(hào)130301）；硝酸為優(yōu)級(jí)純（美國(guó)Merck公司），水為去離子水。銅、砷、鎘、汞和鉛單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，質(zhì)量濃度均為1.000 g/L。

1.3樣品 海螵蛸藥材共30批次，分別購(gòu)自浙江、上海、安徽、河北、江蘇、北京、遼寧等地，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)吳立宏研究員鑒定，均符合《中國(guó)藥典》2010年版一部海螵蛸項(xiàng)下規(guī)定。樣品收集信息見(jiàn)表1。

表1　海螵蛸樣品收集信息Tab.1 Information on cuttlebone samp les collected

2　方法與結(jié)果

2.1粉末顯微鑒別 《中國(guó)藥典》2010年版一部的海螵蛸鑒別項(xiàng)為：本品粉末類(lèi)白色。多數(shù)為不規(guī)則透明薄片，有的具細(xì)條紋。不規(guī)則碎塊，表面顯網(wǎng)狀或點(diǎn)狀紋理［1］。

而經(jīng)過(guò)本課題組進(jìn)一步對(duì)海螵蛸粉末的顯微鑒別，其顯微特征見(jiàn)圖1，可表述為：本品粉末類(lèi)白色。背面角質(zhì)層碎塊多類(lèi)四邊形，表面具橫裂紋和細(xì)密縱紋交織而成的網(wǎng)狀紋理，亦可見(jiàn)只有縱紋的碎塊。中間及腹側(cè)石灰質(zhì)碎塊多具分支狀蛇形管道；棱柱體碎塊基部膨大，柄呈柱狀，有的類(lèi)T形；一般石灰質(zhì)碎塊呈條形、類(lèi)四邊形或不規(guī)則狀，具細(xì)條紋。

圖1　海螵蛸粉末特征Fig.1 Powder characteristics of cuttlebone

2.2碳酸鈣測(cè)定

2.2.1EDTA配制與標(biāo)定 參照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄XV F乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.05 mol/L）的配制與標(biāo)定方法［13］進(jìn)行配制與標(biāo)定。

2.2.2EDTA配位滴定法 取本品細(xì)粉約0.12 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，加稀鹽酸10 mL，沸水浴加熱使溶解，冷卻，加水20 mL與甲基紅指示劑1滴，滴加10%KOH溶液至溶液顯微黃色，繼續(xù)多加10 mL，并加鈣黃綠素指示劑少量，用乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.05 mol/L）滴定至黃綠色熒光消失而顯橙色。每1 mL乙二胺四醋酸二鈉滴定液（0.05 mol/L）相當(dāng)于5.004 mg碳酸鈣（Ca-CO3）。

2.2.3線性關(guān)系考察 分別稱(chēng)取碳酸鈣對(duì)照品0.050 1、0.075 0、0.100 0、0.120 0、0.140 1、0.160 1 g，精密稱(chēng)定，按照“2.2.2 EDTA配位滴定法”，測(cè)定各對(duì)照品消耗EDTA-2Na滴定液的體積。以碳酸鈣對(duì)照品量為橫坐標(biāo)（X），消耗的滴定液體積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程為Y=197.4X（r=0.999 5），表明碳酸鈣在0.050 1～0.160 1 g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4精密度試驗(yàn) 稱(chēng)取碳酸鈣對(duì)照品5份，各約0.10 g，精密稱(chēng)定，依照“2.2.2 EDTA配位滴定法”連續(xù)測(cè)定碳酸鈣量。結(jié)果平均含有量為99.70%，RSD為0.10%，表明該方法精密度良好，符合分析方法的要求。

2.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 稱(chēng)取第3批海螵蛸樣品細(xì)粉5份，各約0.12 g，精密稱(chēng)定，依照“2.2.2”項(xiàng)連續(xù)測(cè)定碳酸鈣。結(jié)果樣品中碳酸鈣平均含有量為92.21%，RSD為0.13%，表明該方法重復(fù)性良好，符合相關(guān)要求。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱(chēng)取第3批海螵蛸樣品細(xì)粉5份，各約0.12 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，加稀鹽酸10 mL，加熱使溶解，放置0、2、4、6、8 h后依照“2.2.2”項(xiàng)測(cè)定碳酸鈣。穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.26%，表明樣品溶解后所含成分在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7加樣回收試驗(yàn) 分別稱(chēng)取一定量的碳酸鈣對(duì)照品9份，精密稱(chēng)定，加入到已知碳酸鈣含有量的第3批次樣品粉末中，加入量分別達(dá)到已知碳酸鈣量的80%、100%、120%，按照“2.2.2 EDTA配位滴定法”測(cè)定碳酸鈣，結(jié)果見(jiàn)表2。平均回收率為100.9%，RSD為0.24%，表明采用該方法測(cè)定樣品中碳酸鈣回收率高，準(zhǔn)確性好。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

2.3樣品測(cè)定 分別稱(chēng)取各批次海螵蛸細(xì)粉約0.12 g，按照“2.2.2”項(xiàng)測(cè)定，每批平行測(cè)定3份，計(jì)算碳酸鈣量（以干燥品計(jì)），結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4檢查

2.4.1水分的測(cè)定 稱(chēng)取各批次海螵蛸細(xì)粉約2 g（過(guò)五號(hào)篩），精密稱(chēng)定，按照《中國(guó)藥典》（2010年版一部）附錄ⅨH水分測(cè)定法第一法［1］進(jìn)行測(cè)定。每批平行測(cè)定3份，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4.2總灰分、酸不溶性灰分的測(cè)定 稱(chēng)取各批次海螵蛸細(xì)粉約2 g（過(guò)五號(hào)篩），精密稱(chēng)定，按《中國(guó)藥典》（2010年版一部）附錄ⅨK總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定法［1］測(cè)定。每批平行測(cè)定3份，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　碳酸鈣、水分、總灰分和酸不溶性灰分的測(cè)定（n= 3）Tab.3 Results of the content of CaCO3，water，ash and acid-insoluble ash（n=3）

2.4.3ICP-MS法測(cè)定海螵蛸中5種重金屬

2.4.3.1ICP-MS測(cè)定工作條件 射頻功率1 250 W，采樣深度7 mm，等離子氣體積流量15.8 L/min，輔助氣體積流量1.0 L/min，載氣體積流量0.9 L/min，采樣錐孔徑1.0 mm，截取錐孔徑0.7 mm，霧化室溫度2℃，數(shù)據(jù)采集重復(fù)3次。

2.4.3.2供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取本品細(xì)粉0.5 g，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加優(yōu)級(jí)純硝酸5 mL，按各微波消解儀的要求密閉樣品消解罐，按表4消解程序消解，消解完全后，冷卻消解液低于60℃，取出消解罐，放冷，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯材料的量瓶中，用去離子水少量洗滌消解罐3次，洗液合并于量瓶中，加入1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)金溶液50μL，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，即得。同時(shí)另加優(yōu)級(jí)純硝酸5 mL，置耐壓耐高溫微波消解罐中，同供試品溶液制備方法制備樣品空白溶液。

表4　微波消解程序Tab.4 M icrowave digestion procedure

2.4.3.3樣品分析 照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅨB鉛、砷、汞、鎘、銅測(cè)定法［1］對(duì)抽取的11批次不同來(lái)源的海螵蛸樣品中鉛、砷、鎘、汞、銅元素進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　5種重金屬檢測(cè)結(jié)果（mg·kg-1，n=3）Tab.5 Results of the content of five kinds of heavy metal（mg·kg-1，n=3）

注：鎘（以Cd計(jì)）最低檢出限為0.003 mg·kg-1汞（以Hg計(jì)）最低檢出限為0.004 mg·kg-1

3　討論

3.1本實(shí)驗(yàn)對(duì)海螵蛸中碳酸鈣量進(jìn)行了測(cè)定，所采用的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可有效地控制海螵蛸質(zhì)量。另外，貝殼類(lèi)藥材所含鈣的存在形式主要為碳酸鈣，也可能含少量磷酸鈣。為研究海螵蛸中磷酸鈣是否對(duì)碳酸鈣的測(cè)定產(chǎn)生影響，采用了磷鉬藍(lán)法［14］測(cè)定海螵蛸中磷酸根的量，結(jié)果顯示磷酸根僅為0.003 4%（g/g）。說(shuō)明海螵蛸中磷酸鈣含有量甚微，海螵蛸中鈣離子主要以碳酸鈣形式存在，通過(guò)本研究建立的方法得到碳酸鈣的含有量結(jié)果是準(zhǔn)確合理的。

本實(shí)驗(yàn)收集了不同產(chǎn)地的海螵蛸共30批，樣品具有一定的代表性，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，不同產(chǎn)地海螵蛸的碳酸鈣含有量范圍為83.20%～95.46%，平均值為90.09%。不同產(chǎn)地海螵蛸的水分含有量范圍為0.92%～2.71%，平均值為1.79%。根據(jù)不同產(chǎn)地海螵蛸的碳酸鈣和水分測(cè)定結(jié)果，暫規(guī)定碳酸鈣含有量不得少于86.0%，可使93%的樣本被覆蓋在合格范圍內(nèi)；海螵蛸水分不得高于2.5%，可使96%的樣本被覆蓋在合格范圍內(nèi)。

3.2由海螵蛸總灰分所測(cè)值均大于80%，可知其屬于生理性灰分高的藥材，經(jīng)分析，所有批次海螵蛸所含總灰分和碳酸鈣含量均相近。因此，碳酸鈣為海螵蛸總灰分的主要組成，這與李蘭等［2］應(yīng)用X-ray的衍射分析和熱分析技術(shù)證明海螵蛸主要成分為碳酸鈣和劉永剛等［15］認(rèn)為海螵蛸主要的功效歸于其豐富的碳酸鈣含量相符合。碳酸鈣對(duì)于一些植物性藥材而言屬于總灰分，但是海螵蛸主要成分為碳酸鈣，屬于其自有成分，可以直接測(cè)定碳酸鈣的量代替測(cè)定總灰分；而其酸不溶性灰分值均未超過(guò)0.34%，說(shuō)明非金屬氧化物如SiO2等、酸不溶性金屬氧化物如AlO3等以及酸不溶性硫酸鹽、鹵化物等酸不溶性灰分含有量甚少，不足以影響海螵蛸質(zhì)量和藥效，無(wú)須作為質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.3中藥中有害重金屬元素通常指銅（Cu）、砷（As）、鎘（Cd）、鉛（Pb）和汞（Hg）等?！吨袊?guó)藥典》2010年版一部對(duì)黃芪、甘草、白芍、丹參、金銀花、西洋參、山楂、枸杞子等重金屬含有量規(guī)定了限度：銅（Cu）≤20.0 mg/kg，砷（As）≤2.0 mg/kg，鎘（Cd）≤0.3 mg/kg，鉛（Pb）≤5.0 mg/kg，汞（Hg）≤0.2 mg/kg。所抽取的11批次海螵蛸樣品，分別來(lái)自不同產(chǎn)地或收集地，取樣具有一定的廣泛性和代表性，結(jié)果5種重金屬元素含有量差別較大，但大部分樣品均檢測(cè)到銅、鎘、鉛、砷，表明這4種元素在海螵蛸樣品中普遍存在。其中銅元素含有量范圍為0.950～23.68 mg/kg，砷元素含有量范圍2.691～8.374 mg/kg，鎘元素含有量范圍為0.150～6.722mg/kg，鉛元素含有量范圍為0～0.200 mg/kg，汞元素均未檢出。經(jīng)比較分析，對(duì)于銅元素，有2個(gè)樣品超過(guò)限度，其余樣品均符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)；而有9個(gè)樣本的鎘元素超過(guò)限度；鉛元素含有量均遠(yuǎn)低于限度；而砷元素含有量均超過(guò)限度，須引起足夠重視。

3.4中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，應(yīng)根據(jù)藥材或飲片的具體特征規(guī)定檢測(cè)項(xiàng)目、真實(shí)反映其質(zhì)量的指標(biāo)和限度，以確保其安全有效。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和海螵蛸藥理文獻(xiàn)資料，經(jīng)綜合分析，將碳酸鈣含有量作為海螵蛸中成分定量測(cè)定項(xiàng)，可建立符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系。

致謝：真誠(chéng)感謝中國(guó)藥科大學(xué)李會(huì)軍教授在海螵蛸粉末顯微鑒定過(guò)程中給予的幫助與支持！

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

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Quality standard for cuttlebone

YU Jing， GU Qing-qing， MIAO Xiao-yao， AN Rui， YOU Li-sha， WANG Xin-hong*
（Shanghai Uniυersity of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

AIM To establish the quality standard for cuttlebone（Sepiae endoconcha）.METHODS The identification of themicroscopic characteristics and the determinations of CaCO3，water content，ash content，acidinsoluble ash and five kinds of heavymetals of cuttlebone from Zhejiang，Shandong，Jiangsu，F(xiàn)ujian，Guangdong，Guangxi，Yunnan，Hainan and Liaoning Province were carried out.RESULTS The methodology validation for the assay of CaCO3presented the good linearity in the range of0.050 1-0.160 1 g，and the average recovery was100.9%with the RSD 0.24%（n=9）.In addition，the RSDs of reproducibility，precision and stability experimentswere 0.13%，0.10%and 0.26%，respectively.As a result，the contentof CaCO3，water，ash and acid-insoluble ash of cuttlebone from different batches ranged from 83.20%to 95.42%，0.92%to 2.71%，83.50%to 95.87%and 0.01%to 0.34%，respectively，and their averageswere 90.09%，1.79%，90.66%and 0.17%，correspondingly.Besides，Cu content of two sampleswas out of limitation，the same to Cd contentof nine samples. CONCLUSION If the standard of CaCO3content is higher than 86.0%，it covers 28 out of30 samples.Otherwise water content is lower than 2.5%，it covers 29 out of 30 samples of cuttlebone.

cuttlebone（Sepiae endoconcha）；quality standard；CaCO3；water content

R284.1

A

1001-1528（2015）03-0583-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.027

2014-04-14

國(guó)家“863”計(jì)劃-海洋生物來(lái)源中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究（2013AA093002）

于 靜（1990—），女，碩士生，主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel：（021）51322450，E-mail：jingyu_peaceful@163.com

王新宏（1963—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物分析。Tel：（021）51322183，E-mail：wangxinh6020@ 126.com