王俊雄，關(guān)怡新，姚善涇

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重組瑞替普酶包涵體制備及其體外復(fù)性

王俊雄，關(guān)怡新，姚善涇

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江杭州 310027）

將攜帶重組瑞替普酶(reteplase, rt-PA)的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)后，誘導(dǎo)表達(dá)獲得包涵體，考察了誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等條件對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)量的影響。在此基礎(chǔ)上，對(duì)高效表達(dá)的rt-PA包涵體體外復(fù)性過程進(jìn)行了詳細(xì)研究。首先利用單因素實(shí)驗(yàn)考察了復(fù)性液pH、GSH濃度、GSH/GSSG比例、蛋白濃度等各種復(fù)性條件對(duì)復(fù)性效果的影響；并結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步研究了高蛋白濃度下復(fù)性后rt-PA酶活變化情況。以0.2 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)，在33℃下培養(yǎng)6 h，每升發(fā)酵液約可獲得1.7 g粗制包涵體。適宜的復(fù)性條件為蛋白濃度50mg·ml-1，pH 10.0，GSH濃度1 mmol·L-1，GSH/GSSG比例8，復(fù)性收率為87.2%。影響高蛋白濃度下rt-PA復(fù)性的關(guān)鍵因素為復(fù)性液初始pH及GSH濃度，在800mg·ml-1蛋白濃度下復(fù)性后rt-PA比活可達(dá)7.54×104IU·mg-1，熒光光譜分析結(jié)果表明復(fù)性后rt-PA恢復(fù)了其天然態(tài)結(jié)構(gòu)。

生物分離；蛋白質(zhì)復(fù)性；二硫鍵；正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；瑞替普酶

引 言

當(dāng)前，血栓栓塞類疾病已經(jīng)成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手，發(fā)病率一直居高不下，是當(dāng)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，因而研制生產(chǎn)高效的溶栓藥物變得非常迫切[1-2]。瑞替普酶(reteplase, rt-PA)作為第三代溶栓藥物代表，是第二代溶栓藥物——組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator, t-PA)的缺失變異體，它在t-PA分子原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了個(gè)別功能域的刪除，而僅保留kringle Ⅱ、蛋白酶兩個(gè)功能域及N端的3個(gè)氨基酸[3]。與t-PA相比，rt-PA具有藥物半衰期長、溶栓作用強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，因而引起了人們的廣泛關(guān)注[4]。從分子結(jié)構(gòu)上看，rt-PA是一條由355個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈非糖基化蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約39×103，包含9對(duì)二硫鍵[5-6]。眾多的自由巰基使其在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)極易發(fā)生二硫鍵的錯(cuò)配，造成目標(biāo)蛋白錯(cuò)誤折疊，以不溶且無活性的包涵體形式存在，需要通過體外重折疊復(fù)性來恢復(fù)其天然構(gòu)象[7]。

稀釋復(fù)性法是一種簡單快捷的蛋白質(zhì)復(fù)性方法，也是其他各種復(fù)性方法的研究基礎(chǔ)。Harris等[8]最早采用稀釋復(fù)性法對(duì)rt-PA進(jìn)行體外復(fù)性研究。此后，研究者們[9-10]通過向復(fù)性體系中添加還原型/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)、巰基乙醇等折疊助劑，試圖通過調(diào)節(jié)復(fù)性環(huán)境中的氧化還原電位來提高rt-PA的復(fù)性收率，但均在較低蛋白濃度下進(jìn)行，難以達(dá)到工業(yè)化要求。一般而言，影響復(fù)性過程的因素眾多，且各操作條件具有一定的交互作用。針對(duì)瑞替普酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本文擬采用單因素實(shí)驗(yàn)并結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定影響rt-PA體外復(fù)性的重要因素，并著重對(duì)高蛋白濃度條件下的復(fù)性過程進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得較高活性的rt-PA，同時(shí)為其他復(fù)性方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

重組rt-PA質(zhì)粒載體為pET-28a，T7啟動(dòng)子，含卡那霉素抗性標(biāo)記，宿主菌為BL21(DE3)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。人t-PA標(biāo)準(zhǔn)品購自上海飛軒生物科技有限公司，rt-PA標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Boehringer-Ingelheim公司，纖維蛋白原與凝血酶購自美國Sigma公司，二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)購自阿拉丁試劑，蛋白酶抑制劑購自上海羅氏制藥有限公司，胰蛋白胨、酵母提取物、三（羥甲基）氨基甲烷(Tris)、尿素、卡那霉素、Triton X-100、還原及氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)購自上海生工，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 重組rt-PA的發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)

將轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒pET-28a/rt-PA的BL21(DE3)菌株以0.1%的比例接種至5 ml LB種子培養(yǎng)基（含50mg·ml-1卡那霉素），于37℃搖床中200 r·min-1振搖培養(yǎng)12 h；然后取1%種子液轉(zhuǎn)接至150 ml 2×YT發(fā)酵培養(yǎng)基（含50mg·ml-1卡那霉素），繼續(xù)振搖培養(yǎng)至OD600約為1.0，加入0.3 mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，在37℃下培養(yǎng)6 h。并對(duì)誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 重組rt-PA包涵體制備及純化

發(fā)酵液于4℃下6000 r·min-1離心10 min收獲菌體，菌體經(jīng)Buffer A（100 mmol·L-1Tris-HCl，100 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）洗滌重懸，向每100 ml 菌懸液中加入20 mg蛋白酶抑制劑，冰浴超聲破碎14 min（超聲3 s，間隔6 s，功率350 W），4℃下8000 r·min-1離心15 min，收獲粗包涵體沉淀。沉淀經(jīng)Buffer B（100 mmol·L-1Tris-HCl，150 mmol·L-1NaCl，2 mol·L-1urea，0.5% Triton X-100，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）洗滌1～2次后，再經(jīng)水洗1次，4℃下8000 r·min-1離心15 min，收獲的沉淀即為純化的rt-PA包涵體。

1.4 重組rt-PA包涵體的溶解及重折疊復(fù)性

將純化后包涵體按1:20（質(zhì)量:體積）的比例用Buffer C （100 mmol·L-1Tris-HCl，8 mol·L-1urea，150 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1EDTA，pH 9.0）溶解，于磁力攪拌器上攪拌5 h后，4℃下10000 r·min-1離心30 min，透析過夜除去DTT，得到rt-PA包涵體變性液。將此變性液以一定稀釋倍數(shù)加至Buffer D （100 mmol·L-1Tris-HCl，1.5 mol·L-1urea，1 mmol·L-1GSH，0.25 mmol·L-1GSSG，1 mmol·L-1EDTA，pH 10.0）中，于25℃的搖床中120 r·min-1振蕩復(fù)性24 h，測定復(fù)性后蛋白濃度和活性。采用單因素實(shí)驗(yàn)并結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)rt-PA體外重折疊復(fù)性過程進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 分析方法

1.5.1 蛋白濃度測定 采用SDS-PAGE[11]對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，其中分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%。Gel Doc 2000凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)電泳圖進(jìn)行分析，確定目標(biāo)蛋白含量。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度[12]。

1.5.2 rt-PA活性測定 采用纖維蛋白平板溶圈法（fibrin agarose plate assay, FAPA）測定復(fù)性后rt-PA活性[9,13-14]。將0.02 g纖維蛋白原溶于5 ml生理鹽水，同時(shí)將0.083 mg凝血酶溶于1 ml生理鹽水，分別于37℃水浴加熱10 min后混勻。另將0.07 g瓊脂糖溶于7 ml生理鹽水，加熱至沸后冷卻，與纖維蛋白溶液混勻，緩慢倒入平板。待凝固后，打孔置于4℃?zhèn)溆?。首先繪制FAPA法標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取不同比活的人t-PA標(biāo)準(zhǔn)品20ml滴于孔中，將加蓋的平板置于37℃培養(yǎng)箱溫育16 h后，用游標(biāo)卡尺分別測量溶圈相互垂直的兩直徑1與2，以其乘積的對(duì)數(shù)(lg12)為縱坐標(biāo)，以人t-PA單位活性的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并線性擬合得式（1），其相關(guān)系數(shù)為0.9965。

=0.2082+1.5279 (1)

待測rt-PA依上述方法操作，將測得的1與2代入式（1），即得對(duì)應(yīng)的單位活性，再根據(jù)測得的蛋白濃度計(jì)算得rt-PA比活(IU·mg-1)，將測得的比活除以標(biāo)準(zhǔn)品比活定義為rt-PA的復(fù)性收率。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，并計(jì)算誤差限。

1.5.3 rt-PA結(jié)構(gòu)分析 以rt-PA標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，采用熒光光譜法分析復(fù)性后rt-PA結(jié)構(gòu)變化，激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射波長記錄范圍為280～460 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 rt-PA的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)劑濃度的確定 將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)至OD600約為1.0后，分別加入不同濃度（0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1 mmol·L-1）的IPTG誘導(dǎo)rt-PA表達(dá)，在37℃下培養(yǎng)6 h，收獲菌體。所得的全細(xì)胞樣品經(jīng)Buffer A重懸，SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)，對(duì)比不同誘導(dǎo)劑濃度對(duì)rt-PA表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，誘導(dǎo)劑IPTG濃度對(duì)rt-PA表達(dá)量影響不大，綜合蛋白表達(dá)量和誘導(dǎo)劑成本，確定合適的誘導(dǎo)劑濃度為0.2～0.3 mmol·L-1。

2.1.2 培養(yǎng)溫度的確定 將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)至OD600約為1.0后，加入終濃為0.3 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)rt-PA表達(dá)，分別于不同溫度（20、25、28、30、33、37℃）下培養(yǎng)6 h，收獲菌體。對(duì)比不同培養(yǎng)溫度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對(duì)rt-PA的影響較顯著，低于28℃的培養(yǎng)溫度不利于菌體的生長和目標(biāo)蛋白的積累，確定合適的培養(yǎng)溫度為33～37℃。

2.1.3 培養(yǎng)時(shí)間的確定 將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)至OD600約為1.0后，加入終濃為0.3 mmol·L-1的IPTG，于37℃搖床分別培養(yǎng)不同時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7、8 h）后收獲菌體。對(duì)比不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長至3 h后，rt-PA蛋白表達(dá)量明顯提高，6 h時(shí)達(dá)到最大值，之后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長rt-PA表達(dá)量變化不大，故確定6 h為合適的培養(yǎng)時(shí)間。

2.2 rt-PA包涵體的分離純化

以上述優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)條件對(duì)rt-PA進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將破胞液、破胞上清與沉淀、包涵體洗滌液上清與沉淀分別用SDS-PAGE進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。由圖可知，破胞液中表達(dá)產(chǎn)物主要位于39×103附近，且離心后大多集中于沉淀中，說明rt-PA主要以包涵體形式存在。經(jīng)測定，每升發(fā)酵液約可獲得1.7 g粗制包涵體，其中rt-PA占45%左右（條帶3）。一般而言，粗制包涵體中除目標(biāo)蛋白外，還含有核酸、脂類、脂多糖和雜蛋白等雜質(zhì)，采用含EDTA、尿素、Triton X-100和NaCl的洗滌液可以在一定程度上提高目標(biāo)蛋白的純度。由圖4可知，用Buffer B洗滌一次后即可除去大部分雜質(zhì)，將目標(biāo)蛋白純度提高到68%，而二次洗滌及水洗的效果并不明顯（條帶4～7）。另外，包涵體變性溶解后，純度將進(jìn)一步提高到85%以上（條帶8）。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)考察影響rt-PA體外復(fù)性過程的重要參數(shù)

為了將溶解后的變性蛋白最大程度地重折疊至天然構(gòu)象，本文采用稀釋法對(duì)其進(jìn)行體外復(fù)性，使其逐步消除變性因素，恢復(fù)生物活性。在蛋白質(zhì)復(fù)性過程中，不同的目標(biāo)蛋白對(duì)復(fù)性環(huán)境有特定的要求。鑒于rt-PA含有9對(duì)二硫鍵，在完全還原的狀態(tài)下，其18個(gè)自由巰基[15]理論上存在34459425種二硫鍵配對(duì)可能性，因此其體外復(fù)性過程具有巨大的挑戰(zhàn)性。據(jù)報(bào)道[16]，在復(fù)性體系中加入1～2 mol·L-1的尿素可以提高復(fù)性收率，且在一定程度上阻礙變性蛋白的聚集反應(yīng)。另外，從工業(yè)化角度出發(fā)，復(fù)性過程通常在室溫（25℃）下進(jìn)行[17]?？紤]到單因素實(shí)驗(yàn)具有簡單易行且直觀清晰等優(yōu)點(diǎn)，本研究針對(duì)影響復(fù)性過程的幾個(gè)重要因素，包括復(fù)性pH、GSH濃度、GSH/GSSG比例、蛋白濃度等進(jìn)行了詳細(xì)研究，旨在為后續(xù)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供合理的數(shù)據(jù)范圍。

2.3.1 rt-PA復(fù)性動(dòng)力學(xué) 在蛋白質(zhì)重折疊過程中，酶活總是伴隨著分子空間結(jié)構(gòu)的形成而變化，然而對(duì)于富含二硫鍵蛋白而言，其采用何種方式折疊成具有活性的天然態(tài)構(gòu)象的機(jī)理仍有待研究。本文首先在初始條件下（蛋白濃度100mg·ml-1，GSH濃度1 mmol·L-1，GSH/GSSG比例4，尿素濃度1.5 mol·L-1，pH 10.0，溫度25℃）對(duì)rt-PA進(jìn)行稀釋復(fù)性，考察其酶活隨時(shí)間的變化，其中0～5 h期間每隔1 h取樣測定活性，而后每隔2 h取樣，結(jié)果如圖5所示。在復(fù)性初始時(shí)，去折疊多肽鏈迅速形成具有一定活性、包含二級(jí)結(jié)構(gòu)甚至三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊中間體，此后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緩慢調(diào)整，在分子內(nèi)疏水作用力推動(dòng)下進(jìn)行二硫鍵的重新配對(duì)，促使更多活性中心的形成，但由于分子間疏水聚集的存在，這個(gè)過程將需要數(shù)小時(shí)來完成，表現(xiàn)為復(fù)性液酶活隨時(shí)間緩慢上升，24 h后基本達(dá)到平衡。

2.3.2 復(fù)性pH對(duì)rt-PA復(fù)性過程的影響 配制不同pH（pH=9.0，9.5，10.0，10.5）的Buffer D，將脫除DTT的rt-PA包涵體變性液緩慢加入其中，控制蛋白終濃度為100mg·ml-1，復(fù)性24 h。復(fù)性緩沖液pH對(duì)rt-PA稀釋復(fù)性的影響情況如圖6所示。由圖可知，當(dāng)pH增加到10.0～10.5時(shí)，蛋白活性顯著提高。一般而言，堿性條件有利于二硫鍵的形成，而酸性條件有利于二硫鍵的打開。另外，由于rt-PA二硫鍵對(duì)數(shù)較多，分子結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，已經(jīng)完成正確配對(duì)的蛋白分子即便處于較強(qiáng)的堿性條件下也不易變性失活[18]。

2.3.3 GSH濃度對(duì)rt-PA復(fù)性過程的影響 在其余組分不變的情況下，將Buffer D中的GSH濃度分別改變?yōu)?.5、1、2、4和8 mmol·L-1，復(fù)性24 h。GSH濃度對(duì)rt-PA稀釋復(fù)性的影響情況如圖7所示。由圖可知，當(dāng)GSH濃度為0.5～2 mol·L-1時(shí)，復(fù)性收率較高；特別地，當(dāng)GSH濃度為1 mmol·L-1時(shí)復(fù)性收率近50%，可見一定濃度范圍的GSH對(duì)富含二硫鍵蛋白質(zhì)的正確折疊至關(guān)重要。復(fù)性過程中，GSH起著催化二硫鍵異構(gòu)的作用，可促進(jìn)二硫鍵重排，然而過高的GSH濃度往往導(dǎo)致二硫鍵氧化形成速率減慢，最終降低復(fù)性效率[19]。

2.3.4 GSH/GSSG比例對(duì)rt-PA復(fù)性過程的影響

將Buffer D中GSH/GSSG比例分別調(diào)節(jié)為1、2、4、8和16，其他條件不變，復(fù)性24 h。GSH/GSSG比例對(duì)rt-PA稀釋復(fù)性的影響如圖8所示。由圖可知，當(dāng)GSH/GSSG比例位于4～16這一較寬的范圍內(nèi)時(shí)，復(fù)性后蛋白活性均較高，并在比例為8時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)椋缓蜴I的蛋白對(duì)復(fù)性體系中的氧化還原環(huán)境要求更為苛刻。GSH/GSSG比例越高，復(fù)性體系的還原能力就越強(qiáng)，但過高的比例不僅不利于二硫鍵形成，且會(huì)減慢二硫鍵的形成速率；相反，GSH/GSSG比例越低，復(fù)性體系的氧化能力就越強(qiáng)，二硫鍵形成速率和蛋白質(zhì)折疊速率都會(huì)加快，但過低的比例將導(dǎo)致二硫鍵錯(cuò)配概率增加，造成沒有活性的蛋白和聚集體的增多，此外強(qiáng)氧化性環(huán)境也不利于錯(cuò)配二硫鍵進(jìn)行異構(gòu)以形成有活性的蛋白質(zhì)[20]。在上述優(yōu)化條件下，復(fù)性后rt-PA的比活與活性收率可分別達(dá)到2.94×105IU·mg-1和50.7%，比優(yōu)化前提高了67%[9]。

2.3.5 蛋白濃度對(duì)rt-PA稀釋復(fù)性的影響 將rt-PA包涵體變性液（初始蛋白濃度2 mg·ml-1）按不同稀釋倍數(shù)加至Buffer D中，使終濃度分別為50、100、300、500、800、1000和1500mg·ml-1，復(fù)性24 h。不同蛋白濃度對(duì)復(fù)性的影響情況如圖9所示。由圖可知，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?0mg·ml-1時(shí)，復(fù)性收率可達(dá)87.2%，而隨著蛋白濃度的增加，活性呈現(xiàn)迅速下降趨勢。當(dāng)?shù)鞍诐舛忍岣叩?00mg·ml-1時(shí)，復(fù)性樣品的活性收率僅為8.6%。這主要是因?yàn)殡S著蛋白折疊的進(jìn)行，折疊中間體往往會(huì)暴露出大量疏水殘基，在分子運(yùn)動(dòng)的驅(qū)使下相互聚集形成沉淀，從而喪失了生物活性，而蛋白濃度的升高加劇了蛋白質(zhì)聚集程度，因此必須將復(fù)性過程蛋白濃度控制在較低水平[21]。但是，過低的蛋白濃度又會(huì)造成復(fù)性液的大量消耗，增加活性蛋白回收的難度。

2.4 利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察高蛋白濃度下的rt-PA復(fù)性效果

為縮短復(fù)性后蛋白的純化流程，降低生產(chǎn)成本，更好地適應(yīng)工業(yè)化的需求，在初步確定了復(fù)性液pH、GSH濃度以及GSH/GSSG比例為復(fù)性過程中關(guān)鍵因素的情況下，本文進(jìn)一步設(shè)計(jì)了3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)[22]，對(duì)高蛋白濃度(800mg·ml-1)下的復(fù)性過程進(jìn)行了研究。其中，3因素分別為復(fù)性液pH(A)、GSH濃度(B)以及GSH/GSSG比例(C)，具體見表1。

表1 rt-PA復(fù)性過程正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design in rt-PA refolding

為了避免由于局部蛋白濃度過高引發(fā)的聚集沉淀，本研究采用流加操作[23]，室溫下用恒流泵以0.5 ml·min-1的流速將待復(fù)性樣品連續(xù)流加至復(fù)性緩沖液中，同時(shí)緩慢攪拌，使變性蛋白濃度始終維持在較低水平，從而減弱了蛋白間的疏水作用，降低了聚集體生成的可能性，提高了復(fù)性效率。以復(fù)性后酶液比活為指標(biāo)，采用直觀分析方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化篩選出各關(guān)鍵因素的最佳水平，以提高高蛋白濃度下的復(fù)性效果。將包涵體變性液分別加入按表1所配制的不同復(fù)性緩沖液中，使蛋白終濃度控制在800mg·ml-1，流加結(jié)束后置于25℃搖床中振蕩復(fù)性24 h，測定復(fù)性后蛋白活性，結(jié)果匯總于表2中。

表2 rt-PA復(fù)性過程正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)直觀分析Table 2 Intuitive analysis of orthogonal experimental design in rt-PA refolding

直觀分析結(jié)果表明，各復(fù)性條件的最佳組合為A3B3C2，即復(fù)性液pH為10.5，GSH濃度為2 mmol·L-1，GSH/GSSG比例為8；極差大小為A>B>C，說明各影響因素的主次順序?yàn)閜H>GSH濃度> GSH/GSSG比例。復(fù)性后rt-PA比活為7.54×104IU·mg-1，復(fù)性收率從優(yōu)化前的8.6%提高到13.0%。方差分析結(jié)果見表3。由表3可知，因素A（復(fù)性液pH）是rt-PA體外復(fù)性過程的關(guān)鍵因素，因素B（GSH濃度）也具有一定的影響，相比之下，因素C（GSH/GSSG比例）并非顯著因素。這說明在高蛋白濃度下，復(fù)性液pH對(duì)rt-PA復(fù)性效果的影響要高于氧化還原電勢的影響。另外，對(duì)800mg·ml-1初始蛋白濃度而言，合適的復(fù)性液pH和GSH濃度均略高于低蛋白濃度下的水平，說明高濃度蛋白的重折疊復(fù)性需要更為嚴(yán)苛的條件，適當(dāng)提高pH與氧化還原對(duì)濃度更有利于rt-PA分子中二硫鍵的正確形成，同時(shí)降低分子間的疏水作用，提高復(fù)性收率。

表3 rt-PA復(fù)性過程正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experimental design in rt-PA refolding

2.5 復(fù)性rt-PA的熒光光譜分析

蛋白質(zhì)的熒光光譜能提供rt-PA中色氨酸殘基周圍微環(huán)境的變化信息，從而反映其復(fù)性過程中結(jié)構(gòu)上的變化。當(dāng)rt-PA分子在295 nm處被激發(fā)時(shí)，得到的即為色氨酸的發(fā)射光譜，變性及復(fù)性后的rt-PA熒光光譜分析結(jié)果如圖10所示。在體外復(fù)性過程中，當(dāng)變性的rt-PA重折疊為天然態(tài)時(shí)，裸露于溶液中的色氨酸殘基逐漸包埋于分子內(nèi)部疏水區(qū)域，其所處的微環(huán)境極性降低，從而引起最大發(fā)射波長max向短波長移動(dòng)，熒光強(qiáng)度減弱。由圖10可知，變性rt-PA的max為352 nm，而復(fù)性后rt-PA的max為340 nm，與天然態(tài)rt-PA一致，說明復(fù)性后的rt-PA已形成了正確的二硫鍵配對(duì)，恢復(fù)其天然態(tài)構(gòu)象。

3 結(jié) 論

本文對(duì)重組瑞替普酶(rt-PA)包涵體的制備及體外復(fù)性過程進(jìn)行了較為詳盡的研究，確定了最優(yōu)的表達(dá)條件以及影響rt-PA體外復(fù)性過程的重要參數(shù)，并通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)高濃度下rt-PA的體外復(fù)性過程進(jìn)行了優(yōu)化。本文研究結(jié)果表明，通過對(duì)復(fù)性過程的優(yōu)化，采用稀釋復(fù)性法處理如rt-PA等富含二硫鍵的蛋白是切實(shí)可行的，并且可以獲得較高的比活，而高蛋白濃度下體外復(fù)性由于折疊過程中大量疏水基團(tuán)的暴露導(dǎo)致產(chǎn)生大量的聚集沉淀，不可避免地面臨收率降低的問題。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，可適當(dāng)提高pH與氧化還原對(duì)濃度，來獲得相對(duì)較高的復(fù)性收率。此外，rt-PA復(fù)性收率的進(jìn)一步提高仍需要進(jìn)行后續(xù)復(fù)性方法的探索和深入研究。

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Preparation of recombinant reteplase inclusion bodies inand its refolding

WANG Junxiong, GUAN Yixin, YAO Shanjing

(College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang, China)

The vector with the gene of recombinant reteplase (rt-PA) was cloned intoBL21(DE3) cells. Over-expression of rt-PA as inclusion bodies was obtained, and renaturation of rt-PAwas investigated. Firstly, single factor experiments were conducted to optimize refolding conditions, including refolding buffer pH, GSH concentration, ratio of GSH to GSSG, rt-PA concentration. On this basis, high concentration protein refolding was further investigated by orthogonal experimental design. Fermentation broth with 1.7 g crude inclusion bodies per liter was obtained after using 0.2 mmol·L-1IPTG as inducer and culturing at 33℃ for 6 h. The refolding yield of rt-PA was up to 87.2% under optimal condition: 50mg·ml-1denatured rt-PA, pH 10.0, 1 mmol·L-1GSH and ratio of GSH to GSSG 8. The key factors affecting refolding of high concentration protein were initial pH and GSH concentration, and specific bioactivity of rt-PA could reach 7.54×104IU·mg-1after refolding at protein concentration of 800mg·ml-1. Fluorescence spectra indicated that structural conformation of refolded reteplase was identical with its native state.

bio-separation; protein refolding; disulfide bond; orthogonal experimental design; reteplase

2014-07-29.

GUAN Yixin, guanyx@zju.edu.cn

10. 11949/j.issn.0438-1157.20141141

TQ 028.8

A

0438—1157（2015）02—0709—08

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21036005）。

2014-07-29收到初稿，2014-10-08收到修改稿。

聯(lián)系人：關(guān)怡新。第一作者：王俊雄（1989—），男，碩士研究生。

supported by the National Natural Science Foundation of China(21036005).