聶 琛,高 政,孫文芳,鄭瑞紅
(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 大連 116031)
論 著
氟西汀預(yù)處理對(duì)SD大鼠腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用
聶 琛,高 政,孫文芳,鄭瑞紅
(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 大連 116031)
目的 探討預(yù)防性應(yīng)用氟西汀對(duì)SD大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用。方法 48只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為腦缺血再灌注組(對(duì)照組,n=24)和氟西汀組(n=24),對(duì)照組與氟西汀組均制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞的腦缺血再灌注模型,分別于術(shù)前14d胃內(nèi)灌注生理鹽水和氟西汀。各組按缺血2 h再灌注2 h、6 h、24h再分為3個(gè)亞組(n=8)。比較相同再灌注時(shí)間點(diǎn)兩組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及缺血側(cè)海馬區(qū)半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)情況。結(jié)果 相同再灌注時(shí)間點(diǎn),氟西汀組較對(duì)照組神經(jīng)功能缺損評(píng)分值降低,其中再灌注2 h及6 h,兩組間比較差異均無(wú)顯著性意義(P>0.05),再灌注24h,兩組間比較差異具有顯著性意義(P<0.05);氟西汀組較對(duì)照組腦梗死體積減小,其中再灌注2 h及6 h,兩組間比較差異均無(wú)顯著性意義(P>0.05),再灌注24h,兩組間比較差異具有顯著性意義(P<0.01);氟西汀組缺血側(cè)海馬區(qū)Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)在相同再灌注時(shí)間較對(duì)照組均減少,差異具有顯著性意義(P<0.05)。結(jié)論 氟西汀具有神經(jīng)保護(hù)作用,預(yù)防性應(yīng)用氟西汀在腦缺血再灌注損傷急性期即起顯著作用,其機(jī)制可能與其減少Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。
氟西汀;腦缺血再灌注;Caspase-3
隨著人口的老齡化,缺血性腦血管病已成為威脅中老年人健康和生存質(zhì)量的常見病和多發(fā)病,腦缺血引起的腦組織損傷不僅見于嚴(yán)重缺血本身,也見于血流再通后。雖然一方面恢復(fù)局部的血流供應(yīng),清除有毒的代謝產(chǎn)物,有利于局部組織的存活和修復(fù),但另一方面它同時(shí)通過(guò)細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等機(jī)制進(jìn)一步加重局部組織損傷,即所謂再灌注損傷。
氟西汀(Fluoxetine,Prozac)是選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRI)的代表性藥物,第一個(gè)應(yīng)用于臨床治療抑郁癥,后來(lái)也用來(lái)治療腦卒中后抑郁,其抗抑郁療效是明確和肯定的。近年來(lái)有臨床實(shí)驗(yàn)研究證明氟西汀具有神經(jīng)保護(hù)作用[1],這種保護(hù)作用可能與其上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子有關(guān)。但目前關(guān)于預(yù)防性應(yīng)用氟西汀對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的研究少有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)預(yù)防性應(yīng)用氟西汀,觀察SD大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積和缺血側(cè)海馬區(qū)半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達(dá)情況,從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度探討預(yù)防性應(yīng)用氟西汀能否減輕腦缺血再灌注損傷,是否具有神經(jīng)保護(hù)作用及其可能的機(jī)制,從而為缺血性腦血管病的臨床治療及以氟西汀為代表的SSRI類藥物在臨床中更廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只,體重180~220 g,由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,分籠溫室飼養(yǎng),自由進(jìn)食飲水,自然晝夜,術(shù)前禁食12 h。
1.2 主要藥品和試劑
氟西汀膠囊(美國(guó)禮萊公司,20 mg/粒,Prozac);兔抗大鼠Caspase-3抗體(美國(guó)NEOMARK公司);氯化三苯四唑啉(TTC)(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司);SP試劑盒、DAB顯色劑(美國(guó)SANTAZ公司)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:48只健康雄性SD大鼠,隨機(jī)分為兩組:腦缺血再灌注組(對(duì)照組,n=24)、氟西汀組(n=24),各組按缺血2 h,再灌注2 h(n=8)、6 h(n=8)、24h(n=8)分為3個(gè)亞組。
1.3.2 大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞的缺血再灌注模型制備:參照改良的 Longa-Zea 氏線栓法[2]制作大鼠大腦中動(dòng)脈(MCA)閉塞的腦缺血再灌注模型,所有大鼠均栓塞右側(cè)MCA。模型成功的標(biāo)志是動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)的Horner征(眼裂變小,眼球內(nèi)陷)和對(duì)側(cè)以前肢為重的偏癱。于栓塞2 h不再麻醉拔出栓線,分別于再灌注后2 h、6 h、24h(每個(gè)亞組8只)處死動(dòng)物。
1.3.3 給藥方法:用生理鹽水將氟西汀膠囊內(nèi)粉末溶解,配制成20 mg/100 mL混懸液。氟西汀組大鼠術(shù)前14d予氟西汀(2.0 mg/kg·d)行灌胃治療,1次/d;對(duì)照組均于術(shù)前14d胃內(nèi)灌注等容積生理鹽水,1次/d。
1. 4 觀察指標(biāo)
1.4.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分:參照Z(yǔ)ea-Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分別于再灌注后2 h、6 h、24h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分:無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:不能伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向偏癱側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失。
1.4.2 腦梗死體積的測(cè)定:于不同再灌注時(shí)間點(diǎn)過(guò)量水合氯醛腹腔注射麻醉處死大鼠,迅速斷頭取腦速凍15min,經(jīng)視交叉水平行冠狀切片(腦片厚度約1.5mm,共A、B、C、D、E 5個(gè)腦片),C片常規(guī)做石蠟包埋,用做免疫組化和HE染色,其余腦片置于2% TTC磷酸鹽緩沖液中避光,37 ℃恒溫溫育30 min,10%福爾馬林后固定,正常腦組織著深紅色,梗死腦組織不著色。各腦片在同等條件下用數(shù)碼相機(jī)正反面拍照,采用病理圖像分析儀系統(tǒng)測(cè)定每片梗死面積及該片總面積,按公式:[ (各片正反面梗死面積之和/ 2) ×片厚]/ [ (各片正反面總面積之和/ 2) ×片厚]] ×100 %計(jì)算出梗死體積/大腦體積百分比,以此作統(tǒng)計(jì)分析。其中第C片腦片正反面面積以B及D片相鄰面表示。
1.4.3 用SP免疫組織化學(xué)法測(cè)定Caspase-3的表達(dá):顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,鏡下胞漿有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞,陰性結(jié)果則無(wú)棕黃色顆粒。每張切片在40×10倍光鏡下隨機(jī)選取海馬區(qū)內(nèi)4個(gè)不重疊的視野,分別計(jì)數(shù)Caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量,取均值作為各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分
相同再灌注時(shí)間點(diǎn),氟西汀組較對(duì)照組神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低,其中再灌注2 h及6 h,兩組間比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05),再灌注24h,兩組間比較差異有顯著性意義(P<0.05)。見表1。
2.2 腦梗死體積測(cè)定
相同再灌注時(shí)間點(diǎn),氟西汀組較對(duì)照組腦梗死體積減小,其中再灌注2 h及6 h,兩組間比較差異無(wú)顯著性意義(P>0.05),再灌注24h時(shí)兩組間比較差異有顯著性意義(P<0.01)。見表2、圖1。
表1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分在兩組各再灌注時(shí)間點(diǎn)的比較
表2 梗死體積/總體積百分比在兩組各再灌注時(shí)間點(diǎn)的比較
圖1 再灌注24h兩組間腦梗死體積的比較
2.3 免疫組化結(jié)果
氟西汀組較對(duì)照組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)減少,其中再灌注2 h、6 h時(shí)兩組間比較均為P<0.05,再灌注24h時(shí)兩組間比較P<0.01。見表3、圖2。
表3 Caspase-3表達(dá)在兩組各再灌注時(shí)間點(diǎn)的比較
氟西汀作為SSRI的代表性藥物,第一個(gè)應(yīng)用于臨床治療抑郁癥,后來(lái)也用于治療腦卒中后抑郁,其抗抑郁機(jī)制為:氟西汀能選擇性作用于5-羥色胺(5-HT)輸送體,抑制5-HT的再攝取,增高突觸間隙中的5-HT濃度。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)氟西汀的研究大多集中于其改善抑郁癥狀及卒中后抑郁,并發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)卒中后抑郁患者的神經(jīng)功能康復(fù)。Dam等[3]發(fā)現(xiàn)氟西汀的與其促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)無(wú)關(guān)。周波等[4]利用氟西汀對(duì)腦卒中后非抑郁患者進(jìn)行干預(yù)性治療,發(fā)現(xiàn)氟西汀可以明顯改善腦卒中后非抑郁患者的神經(jīng)功能和日常生活能力。王占軍等[5]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期預(yù)防性應(yīng)用氟西汀可以通過(guò)增加梗死灶周圍和缺血損傷側(cè)海馬區(qū)BDNF的表達(dá)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。上述研究均提示:氟西汀在一定程度上對(duì)單純腦卒中患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有修復(fù)作用[6],但作用機(jī)制不明。
氟西汀的神經(jīng)保護(hù)作用可能與以下機(jī)制有關(guān):(1)長(zhǎng)期應(yīng)用氟西汀可以促進(jìn)5-HT遞質(zhì)的功能。5-HT可以促進(jìn)突觸的形成,增強(qiáng)5-HT能突觸的傳遞作用,提高脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能,從而通過(guò)改善神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能促進(jìn)腦損傷后的功能恢復(fù)[7]。(2)長(zhǎng)期應(yīng)用氟西汀可以上調(diào)5-HT2受體改善運(yùn)動(dòng)功能[8]。(3)長(zhǎng)期應(yīng)用氟西汀還可以上調(diào)腎上腺素受體從而間接加快運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[9]。(4)氟西汀能促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[10],增加齒狀回新生細(xì)胞的數(shù)量[11]。
圖2 兩組各再灌注時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)比較 (×400)
近年來(lái)大量研究已證實(shí)腦缺血再灌注后有細(xì)胞凋亡出現(xiàn),凋亡是基因控制的程序性級(jí)聯(lián)過(guò)程,而Caspase家族在這個(gè)過(guò)程中起關(guān)鍵作用,其中Caspase-3與線蟲的死亡基因ced-3同源性最高。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,Caspase-3不僅可以促進(jìn)腦發(fā)育時(shí)期神經(jīng)元的凋亡,還可促進(jìn)各種因素誘導(dǎo)的成熟神經(jīng)元的凋亡,是Caspase級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用[12]。上述研究均說(shuō)明Caspase-3可促使腦缺血后遲發(fā)性神經(jīng)元死亡,其表達(dá)的量決定了最終梗塞灶的大小。
本研究發(fā)現(xiàn),缺血再灌注損傷后可誘導(dǎo)Caspase-3表達(dá)增加,說(shuō)明缺血再灌注損傷誘導(dǎo)了凋亡發(fā)生,氟西汀組相同再灌注時(shí)間點(diǎn)梗死體積明顯減少,神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低,Caspase-3表達(dá)明顯下降,表明Caspase-3參與了氟西汀介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用的調(diào)控。
綜上所述,在本研究所考查因素范圍內(nèi),預(yù)防性應(yīng)用氟西汀能減輕SD大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷,減輕神經(jīng)功能缺損癥狀,縮小梗死體積,使缺血側(cè)海馬區(qū)Caspase-3表達(dá)減少。氟西汀具有神經(jīng)保護(hù)作用,預(yù)防性應(yīng)用氟西汀在腦缺血再灌注損傷急性期即起顯著作用,這種神經(jīng)保護(hù)作用可能與其減少Caspase-3的表達(dá),從而下調(diào)凋亡基因的表達(dá),抑制反應(yīng)性凋亡來(lái)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用,但其抑制凋亡途徑的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
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Protective effect of fluoxetine pretreatment on focal cerebral ischemia reperfusion damage in SD rat
NIE Chen, GAO Zheng, SUN Wen-fang, ZHENG Rui-hong
(DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116031,China)
Objective To discuss the protective effect of fluoxetine pretreatment on focal cerebral ischemia reperfusion damage in SD rat. Methods Forty-eight healthy male SD rats were established ischemia-reperfusion model in right cerebral middle artery. They were randomly divided into 2 groups, control group and fluoxetine group. 0.9% sodium chloride (10 mL/kg·d) and fluoxetine 0.9% sodium chloride solution (2.0 mg/kg·d) was given respectively to control group and fluoxetine group by gastric gavage at the same time since the 14th day before ischemia-reperfusion.Each group was divided evenly into 3 subgroups according to reperfusion 2 h, 6 h, 24h after ischemia for 2 h. The neurologic impairment score, cerebral infarction volume, and Caspase-3 expression in the ischemia side of hippocampus tissue were compared between two groups. Results Comparing with control group, the neurologic impairment score and the infarction volume decreased in fluoxetine group at the same time point. There were no significant difference between two groups except in the group of reperfusion 24h following cerebral ischemia 2 h (P<0.01). The expression of Caspase-3 in the ischemia side of hippocampus tissue decreased at 3 time points of reperfusion in fluoxetine group than that in control group. Conclusion Fluoxetine could have a neuroprotective effect on cerebral ischemia-reperfusion. The protective effect could be related to inhibiting Caspase-3 expression.
fluoxetine; ischemia reperfusion; Caspase-3
10.11724/jdmu.2015.06.08
聶 琛(1982-), 女, 遼寧大連人, 主治醫(yī)師。 E-mail: niechen216789@126. com
高 政, 教授。 E-mail: bygzyz@163. com
R971
A
1671-7295(2015)06-0552-04
聶琛,高政,孫文芳,等. 氟西汀預(yù)處理對(duì)SD大鼠腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,37(6):552-555,559.
2015-04-26;
2015-10-31)