施學(xué)清

(大連市第二人民醫(yī)院 皮膚科，遼寧 大連 116011)

論 著

miR-34a通過靶向抗凋亡基因Survivin抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖的研究

施學(xué)清

(大連市第二人民醫(yī)院 皮膚科，遼寧 大連 116011)

目的 研究miR-34a在皮膚鱗狀細(xì)胞癌(SCC)中的表達(dá)及對腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡的調(diào)控作用及機制。方法 采用實時定量PCR檢測46例SCC病人腫瘤組織及15例正常皮膚組織中miR-34a及Survivin的表達(dá)；將miR-34a mimic轉(zhuǎn)染進皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞系，探討miR-34a對SCC細(xì)胞增殖、Survivin表達(dá)的影響；評估m(xù)iR-34a及Survivin表達(dá)對SCC預(yù)后的生物診斷價值。 結(jié)果 (1)低分化SCC患者miR-34a顯著低于高分化組，而Survivin則顯著高于高分化組(P均<0.05)。與正常皮膚比較，SCC病人的miR-34a顯著降低，而Survivin表達(dá)則顯著提高，P值分別為0.0013及<0.0001，差異均有極顯著性意義。(2)與未轉(zhuǎn)染組相比，miR-34a mimic可以顯著抑制A431細(xì)胞增殖(P<0.05)；同時顯著降低Survivin蛋白表達(dá)(P<0.01)。(3)高miR-34a表達(dá)的SCC患者生存率顯著高于低表達(dá)者，P=0.020567；高Survivin表達(dá)的SCC患者生存率則顯著低于高表達(dá)者，P=0.008198。 結(jié)論 miR-34a可通過對Survivin表達(dá)調(diào)控影響SCC細(xì)胞增殖，同時它也可作為一個很好的生物學(xué)診斷指標(biāo)為評估SCC病人預(yù)后提供參考。

皮膚鱗狀細(xì)胞癌；miR-34a；Survivin；增殖

在中國，每年約有250萬人罹患皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma， SCC)，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢[1-3]，是導(dǎo)致非黑色素瘤皮膚癌患者死亡的主要病因。SCC侵襲力高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)期預(yù)后差[1-2]。因此，探索皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生機制，尋找其發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵調(diào)控因子可以為SCC的分子治療奠定基礎(chǔ)。

MicroRNA(miRNA)是一類高度保守，長度約為22～25nt小非編碼RNA，通過對靶基因表達(dá)進行調(diào)控，在作發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及代謝等方面均發(fā)揮重要作用[4-6]。Survivin 基因是近年新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族成員之一，可以抑制細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞增殖，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。Survivin在人類腫瘤及胚胎組織中呈高表達(dá)，但在成人的正常組織中則很少表達(dá)[7-8]。

miR-34家族包括3個主要成員，miR-34a、miR-34b和miR-34c。基因表達(dá)譜已證實在腫瘤細(xì)胞中miR-34a表達(dá)下調(diào)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a能夠降低肺癌細(xì)胞中的Survivin啟動子活性。此外，在惡性黑色素瘤細(xì)胞中也被證實能夠抑制Survivin表達(dá)并且降低促分裂原活化蛋白激酶活性[10]。目前關(guān)于miR-34a通過Survivin表達(dá)調(diào)控在SCC發(fā)病機制中的作用還未見報道。本文旨在探索miR-34a在SCC組織及A431細(xì)胞系中的表達(dá)，及miR-34a影響SCC細(xì)胞增殖的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材 料

DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；Lipofectamine 2000(Invitrogen，德國)；miR-34a mimic(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，上海，中國)；CellTiter 96?AQueous非放射性細(xì)胞增殖分析試劑盒(Cat.No.P9625； Promega Co.，美國)；TRIzol(Invitrogen， Karlsruhe， 德國)；TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems， Foster City CA， 美國)；兔抗人Survivin抗體(Abcam， Cambridge， 英國)；山羊抗兔抗體(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，美國)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，美國)；Mx3000P QPCR系統(tǒng)(美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 病例資料：46例皮膚鱗癌患者均來自2009—2013年間大連市第二人民醫(yī)院皮膚及普外科，經(jīng)病理活組織檢查證實為皮膚鱗狀細(xì)胞癌，其中男性26例，女性20例；年齡32～75歲，平均年齡53歲；病程2個月～10年，平均病程18.26個月；根據(jù)Border改良分級標(biāo)準(zhǔn)，I級22例，II級19例，III級5例，IV級0例。I、II級為高分化鱗癌，III、IV級為低分化鱗癌。全部病例術(shù)前均未接受任何抗癌治療。另取15例正常組織做對照。對照組性別、年齡等與鱗癌患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃，100%濕度，5%CO2孵箱單層傳代培養(yǎng)。每隔48～72 h更換一次培養(yǎng)基。實驗選用對數(shù)生長期的細(xì)胞(培養(yǎng)24h后)。

1.2.3 轉(zhuǎn)染miR-34a mimic：將A431細(xì)胞鋪于無抗生素的6孔培板皿中，細(xì)胞密度為2×105個/孔。24h后，利用Lipofectamine 2000將miR-34a mimic轉(zhuǎn)染進A431細(xì)胞，轉(zhuǎn)染濃度分別為60 nmol/L，80 nmol/L，100 nmol/L。miR-34a mimic的序列如下：5′-UGG CAG UGU CUU AGC UGG UUG U-3′及5′-ACA ACC AGC UAA GAC ACU GCC A-3′。其非特異性對照組(non-specific control， NC)的序列如下：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′及5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞進行后續(xù)分析。

1.2.4 四唑化合物(MTS)分析：將A431細(xì)胞以1×103個/孔的密度種于96孔板中，待轉(zhuǎn)染miR-34a mimic及NC 48 h后，利用CellTiter 96?AQueous非放射性細(xì)胞增殖分析試劑盒分析細(xì)胞增殖活性。向每孔含有100 μL培養(yǎng)基的96孔板中加入20 μL的MTS與電子偶聯(lián)劑(PMS)混合溶液，放入37 ℃加濕的含5%CO2孵箱中孵育1 h，然后利用酶標(biāo)儀(PowerWavex 340，Instruments有限公司，美國)讀取490 nm的吸光度。

1.2.5 總RNA提取及實時定量及半定量RT-PCR：組織、A431細(xì)胞及分別轉(zhuǎn)染NC序列和100 mol/L miR-34a mimic的A431細(xì)胞的總RNA提取，按TRIzol試劑說明書操作。實時定量RT-PCR檢測miR-34a及Survivin表達(dá)。RT采用TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR采用ABI miRNA特殊引物試劑盒并通過Mx3000P(美國)QPCR系統(tǒng)來進行。U6 RNA作為內(nèi)參。實時PCR反應(yīng)條件：95℃ 15min，94℃ 15s 40個循環(huán)，55℃ 30 s，70 ℃ 30 s。產(chǎn)物通過SYBR-Green I進行檢測。以比較Ct值[2-△ct]法檢測miR-34a及Survivin實時PCR表達(dá)。各引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.2.6 Western blotting分析：在細(xì)胞和組織中加入蛋白裂解液(1 mL RIPA和10 μL PMSF)，待完全裂解后，利用12%SDS-PAGE進行電泳分離蛋白(總蛋白上樣量為40 μg)，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，Bedford，MA，美國)。將膜放入封閉液(5%脫脂奶粉)中封閉2 h后，加入兔抗人Survivin抗體4℃過夜，再加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗兔抗體室溫孵育2 h，β-actin作為內(nèi)參。

隨訪時間6～58個月?？偵嫫谥笍氖中g(shù)日期到最后一次隨訪或死亡的時間間隔(月)，分別以患者miR-34a及Survivin mRNA表達(dá)均值作為分層依據(jù)，觀察miR-34a及Survivin表達(dá)水平對皮膚鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的評估價值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 SCC病人癌組織及正常皮膚組織中miR-34a及Survivin表達(dá)情況

結(jié)果顯示不同年齡組(<60歲組及≥60歲組)SCC病人中，miR-34a及Survivin mRNA表達(dá)無明顯差異。而根據(jù)改良的Border分級法，低分化SCC患者miR-34a顯著低于高分化組，而Survivin則顯著高于高分化組(P均<0.05)。與正常皮膚比較，SCC病人的miR-34a顯著降低，而Survivin表達(dá)則顯著提高，P值分別為0.0013及<0.0001，差異均有極顯著性意義，見表2。

表2 SCC病人癌組織及正常皮膚組織中miR-34a及Survivin mRNA表達(dá)及臨床病理特征

2.2 miR-34a轉(zhuǎn)染對A431細(xì)胞增殖活性的影響

MTS檢測發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組(non-transfection，NT)及陰性對照組(NC)相比，miR-34a mimic轉(zhuǎn)染后能夠顯著抑制A431細(xì)胞增殖活性，并且具有劑量依賴關(guān)系。NT與NC組間差異未見顯著性意義。見圖1。

圖1 miR-34a對A431細(xì)胞增殖的影響

2.3 miR-34a對A431細(xì)胞Survivin mRNA及蛋白的表達(dá)調(diào)控

qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34a mimic 48 h后，miR-34a表達(dá)較NC組顯著提高，P<0.001，但未見Survivin mRNA表達(dá)增高，見圖 2A和B。

Western blotting結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48 h后，miR-34a mimic組Survivin蛋白表達(dá)均顯著低于NT組及NC組(P均<0.001)，見圖2C。

圖2 miR-34a對Survivin的表達(dá)調(diào)控

2.4 生存分析

對全部46名SCC患者進行隨訪。其中死亡8例，失訪2例?？?年生存率為78.26%(36/46)。Kaplan-Meier生存分析，見圖3。

圖3 Kaplan-Meier生存分析

3 討 論

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是中國常見的皮膚惡性腫瘤之一，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致非黑色素瘤皮膚癌患者死亡的主要病因。因此，尋找其發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子對鱗癌的診斷和治療是必不可少的。

以siRNA及miRNA模擬物為手段的RNA治療方案為腫瘤的治療提供了新的方向和策略[11]。miRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類小的非編碼RNA，主要參與對目的基因的負(fù)性調(diào)控。研究顯示，miRNA對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著廣泛的影響[4-6]。miR-34a是2007年首次發(fā)現(xiàn)的p53通路的下游靶基因，它能夠誘導(dǎo)凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[12]。很多研究顯示，miR-34a在多種腫瘤中表達(dá)降低[9]。

Survivin是IAPs家族的新成員，能夠抑制細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞增殖，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。很多研究顯示miR-34a與Survivin與多種腫瘤密切相關(guān)[13-14]。然而，miR-34a與Survivin在人類皮膚鱗癌發(fā)病機制中的作用并沒有充分的報道。本研究中，SCC病人腫瘤組織中miR-34a表達(dá)顯著低于正常皮膚組織，Survivin表達(dá)則顯著高于正常皮膚組織。不同分化程度的SCC腫瘤組織中也存在這一變化趨勢，提示miR-34a與Survivin在SCC發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

為了進一步探討miR-34a、Survivin及相關(guān)調(diào)控在SCC發(fā)病機制中的作用，本研究選用了人類皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431作為研究模型。研究結(jié)果顯示，miR-34a mimic能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時降低細(xì)胞內(nèi)Survivin蛋白的表達(dá)，但對Survivin mRNA表達(dá)則沒有顯著的影響。這一結(jié)果提示，miR-34a很可能是通過對SCC細(xì)胞內(nèi)Survivin進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，Kaplan-Meier生存分析的結(jié)果顯示miR-34a及Survivin均可以作為比較好的SCC病人預(yù)后評估指標(biāo)。

這些結(jié)果提示，miR-34a可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)Survivin進而影響SCC細(xì)胞的凋亡、增殖，從而參與了SCC的發(fā)生發(fā)展，同時它也可以作為一個很好的生物學(xué)診斷指標(biāo)為評估SCC病人預(yù)后提供參考。

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miR-34a affect the proliferation of squamous cell carcinoma by targeting SurvivinSHI

Xue-qing

(DepartmentofDermatology,theSecondPeople’sHospitalofDalian,Dalian116011,China)

Objective To analyze the relationship between miR-34a and Survivin in proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma (SCC). Methods miR-34a and Survivin expression in SCC tissues were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction. miR-34a mimic was transfected into SCC cell line A431 to increase its level. The effects of miR-34a on cell proliferation and Survivin expression were tested by MTS, semi-RT-PCR and western blotting analyses. Results The expression of miR-34a was significantly lower in SCC tissue than that in normal tissue, and lower in low differentiation SCC than that in high differentiation SCC. Survivin expression was higher in SCC tissue than that in normal tissue, and higher in low differentiation SCC than that in high differentiation SCC. The miR-34a expression was positively correlated with histologic differentiation and negatively correlated with Survivin expression. The transfection of miR-34a mimic significantly suppressed cell proliferation and decreased Survivin protein expression, but did not affect Survivin mRNA expression level. SCC patients with miR-34a high expression and Survivin low expression have a better prognosis. Conclusion miR-34a could affect the occurrence of SCC by targeting antiapoptotic gene Survivin.

squamous cell carcinoma; miR-34a; Survivin; proliferation

10.11724/jdmu.2015.06.07

施學(xué)清(1970-)，女，遼寧大連人，副主任醫(yī)師。E-mail：dajia-luntan@dl.cn

R739.5

A

1671-7295(2015)06-0547-05

施學(xué)清. miR-34a通過靶向抗凋亡基因Survivin抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015,37(6)：547-551.

2015-09-21；

2015-11-03)