劉純青，申林林，欒 藝，劉 娜

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 2010級(jí)七年制7班， 遼寧 大連 116044； 3.大連醫(yī)科大學(xué) 2011級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)3班， 遼寧 大連 116044)

論 著

CeO2的制備、表征及對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

劉純青1，申林林2，欒 藝3，劉 娜1

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044； 2.大連醫(yī)科大學(xué) 2010級(jí)七年制7班， 遼寧 大連 116044； 3.大連醫(yī)科大學(xué) 2011級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)3班， 遼寧 大連 116044)

目的 制備納米氧化鈰(nanoceria，CeO2)，初步探討其對(duì)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC12氧化損傷的保護(hù)作用。方法 采用均相沉淀法制備納米CeO2，對(duì)其晶粒大小和晶粒形貌進(jìn)行表征。將粗濃度為250 mmol/L的CeO2加入PC12細(xì)胞培養(yǎng)液，通過20 μmol/L H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，建立PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷模型，采用MTT法檢測(cè)對(duì)照組、CeO2組、CeO2+H2O2組，H2O2組的細(xì)胞活性，測(cè)定CeO2對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果 采用均相沉淀的方法合成粒子直徑為5～10 nm的CeO2。 MTT實(shí)驗(yàn)顯示H2O2組細(xì)胞存活率為(74.61±3.97)%，CeO2+H2O2組的細(xì)胞存活率為(99.21±4.01)%，明顯高于H2O2組(P<0.05)。結(jié)論 CeO2對(duì)H2O2造成的氧化損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用。

CeO2；制備；PC12細(xì)胞；抗氧化損傷

由于納米氧化鈰(nanoceria，CeO2)具有獨(dú)特的氧化還原性能，在稀土氧化物系列中具有較高的催化活性，因此受到各國(guó)科學(xué)家的極大關(guān)注。目前CeO2及其復(fù)合材料已成功用于汽車尾氣的催化凈化。由于鈰元素具有特殊的電子結(jié)構(gòu)，可隨環(huán)境的變化而從Ce4+變價(jià)到Ce3+，在生物環(huán)境中具有抗氧化作用，因此在氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的衰老、腫瘤和神經(jīng)退行等多種疾病的防治中具有重要作用[1-3]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)退行疾病在西歐、北美的發(fā)病率是世界年均發(fā)病率的10倍，CeO2作為抗氧化劑在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[4-5]。目前，中國(guó)也將面臨著人口老齡化的問題，神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默病和帕金森病正在迅速地增加，研究CeO2對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞損傷的保護(hù)作用具有極其重要的意義和良好的應(yīng)用前景。PC12細(xì)胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤克隆的細(xì)胞株，常用于分析神經(jīng)元分化和神經(jīng)毒理作用的研究。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究所制備的CeO2的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，及其對(duì)體外H2O2損傷PC12細(xì)胞的生物保護(hù)作用進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1 均相沉淀法制備CeO2

將含有0.1 mol硝酸鈰銨和3 mol尿素的混合溶液在攪拌下加熱煮沸，使其充分反應(yīng)；將沉淀過濾后用去離子水反復(fù)洗滌后烘干，得到CeO2前驅(qū)體。將上述方法制得的樣品前驅(qū)體在773K馬弗爐中焙燒2 h，得到CeO2。稱取1.723 g CeO2，分散于PBS溶液中超聲30 min，制得粗濃度為250 mmol/L的PBS-CeO2液，采用濾膜過濾除菌后，液體備用。用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)對(duì)CeO2的濃度進(jìn)行定量測(cè)定。

1.2 CeO2表征

CeO2物相是在RINTD/MAX-2500PC型X射線衍射儀(XRD)上測(cè)定，采用Cu Kα射線源，管壓40 kV，管流100 mA，掃描速度5°/min，測(cè)量范圍2θ=20°～65°，步長(zhǎng)為0.02。根據(jù)謝樂(Scherrer)方程計(jì)算CeO2晶粒的大小：

d=0.89λ/βcosθ

(1-1)

其中d為粒子的平均粒徑，λ=0.154056 nm，為X射線波長(zhǎng)，θ為三強(qiáng)峰衍射角的半角，β為半峰寬(弧度值)。

采用JEOL(日本電子株式會(huì)社)JEM-2000EX透射電鏡(TEM)對(duì)粉體的顆粒大小進(jìn)行觀測(cè)。首先將樣品在乙醇溶液中超聲分散，然后取懸浮液滴在鍍碳膜的銅網(wǎng)上，待乙醇在空氣中自然揮發(fā)后，在透射電鏡下觀測(cè)樣品顆粒的大小及形貌。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12 細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株)由中科院上海細(xì)胞庫引入，培養(yǎng)于10%滅活的胎牛血清和5%滅活馬血清的高糖含丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。隔天換1次液，待細(xì)胞均勻生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶5d左右傳代1次，用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞形成神經(jīng)突起，交織成網(wǎng)絡(luò)，分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以5×104/mL密度，每孔200 μL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。CeO2+H2O2組種植后48 h先以粗濃度為250 mmol/L PBS-CeO2處理PC12細(xì)胞24h，在此基礎(chǔ)上再給予20 μmol/L H2O2處理細(xì)胞30 min, 后棄去培養(yǎng)液，再次換上含有PBS-CeO2的新培養(yǎng)液繼續(xù)處理24h。之后，每孔加入MTT 10 μL，4h后小心吸去孔內(nèi)液體，加入100 μL DMSO，充分振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度(OD)。PBS-CeO2或H2O2單獨(dú)給藥組及對(duì)照組給予上述相同處理，以PBS代替藥物，每個(gè)處理組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，取平均值作為本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。各組平均吸光度需減去空白對(duì)照吸光度(不含細(xì)胞)，計(jì)算各組細(xì)胞存活率(實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，進(jìn)行各組間差異的統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析(F檢驗(yàn))，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 XRD譜圖

測(cè)樣品均形成了均一的CeO2，見圖1。采用謝樂公式計(jì)算樣品的粒徑大小為9.2 nm。

圖1 CeO2的XRD譜圖

2.2 TEM表征

TEM下，CeO2樣品的顆粒呈球形，且粒徑分布基本均勻，顆粒尺寸范圍為5～10 nm。見圖2。

圖2 CeO2樣品的TEM照片

2.3 CeO2對(duì)H2O2氧化損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

H2O2組的細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比，差異有顯著性意義(P<0.05)；CeO2+H2O2組的細(xì)胞存活率與H2O2組相比，差異有顯著性意義(P<0.05)。見表1。

表1 CeO2對(duì)H2O2氧化損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

3 討 論

2006年McGinnis等將CeO2納米顆粒注入小鼠眼中，發(fā)現(xiàn)這種化合物能保護(hù)小鼠的視網(wǎng)膜免受照明的損傷。如果在損傷后再注入這種化合物，還可使眼睛痊愈。這主要是基于CeO2納米顆粒具有抑制活性氧的功效。McGinnis等進(jìn)一步報(bào)告CeO2作為抗氧化劑在生物醫(yī)學(xué)中的合成和潛在的應(yīng)用，并認(rèn)為由于CeO2特殊的氧化還原性能，使得其在應(yīng)用中具有一次給藥長(zhǎng)期有效的特點(diǎn)[1]。研究表明導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變的原因之一就是氧化應(yīng)激，活性氧增加。神經(jīng)元對(duì)ROS攻擊特別敏感，ROS過量，神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能受到破壞。CeO2納米顆粒能有效抑制由活性氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而對(duì)氧化應(yīng)激損傷具有較好的保護(hù)作用。2007年Singh等[2]報(bào)告CeO2在神經(jīng)退行性疾病治療中的抗氧化功效。Seal等[3]研究發(fā)現(xiàn)氧化鈰具有單分散性，催化超氧化岐化酶活性，用于治療因氧化應(yīng)激損傷的生物組織，包括組織培養(yǎng)及動(dòng)物細(xì)胞等，增加細(xì)胞壽命，保護(hù)細(xì)胞免受輻射損傷，促進(jìn)超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2。

本實(shí)驗(yàn)中，由圖1 CeO2的3個(gè)特征峰可知，所測(cè)樣品均形成了均一的CeO2立方晶項(xiàng)，采用謝樂公式計(jì)算樣品的粒徑大小為9.2 nm。圖2的TEM照片與謝樂公式計(jì)算所得粒徑大小的結(jié)果基本一致。表明采用均相沉淀法制備的CeO2具有粒度均一，粒徑大小在5～10 nm左右。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CeO2基本不影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，細(xì)胞存活率為(101.75±3.16)%，具有細(xì)胞相容性，而H2O2氧化損傷對(duì)細(xì)胞有顯著的損傷作用，CeO2對(duì)H2O2造成的氧化損傷具有保護(hù)作用。這與其他研究者在不同的研究體系中得到的結(jié)論相似。

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，已報(bào)告的CeO2研究主要用到的細(xì)胞模型為βTC-tet，BT474，A549，誘導(dǎo)的BEAS-2B和J774A，HT22等[6-8]。Jakupec等[9]研究認(rèn)為CeO2之所以有生物學(xué)活性的一個(gè)主要原因是由于Ce3+和Ca2+的離子半徑接近，因而有可能部分替代鈣離子而表現(xiàn)其生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)CeO2具有抑菌，殺菌和抗癌抗菌等功能。文獻(xiàn)報(bào)告及本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明CeO2在醫(yī)藥方面有很好的應(yīng)用前景[10-11]，但鈰基氧化物對(duì)生物體的影響仍需要作進(jìn)一步深入的探討。

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Preparation, characterization of nanoceria and its protection on oxidative damage of PC12 cells

LIU Chun-qing1, SHEN Lin-lin2, LUAN Yi3, LIU Na1

(1.CollegeofMedicalLaboratory,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China; 2.DepartmentofClinicalMedicineinSeven-yearof2010Grade，DalianMedicalUniversity,Dalian116044，China; 3.MedicalLaboratoryof2011Grade，DalianMedicalUniversity,Dalian116044，China)

Objective To prepare nanoceria (CeO2) and to investigate the protective effect on oxidative damage of Pheochromocytoma cell (PC12). Methods Homogenous precipitation method was used to prepare the nanoceria. XRD and TEM were used to characterize and determine the size of CeO2. 250 mmol/L rough concentration of CeO2was added into PC12 cell culture fluid. Cells were induced and damaged by 20 μmol/L H2O2. And oxidative stress damage model of PC12 cell was set up. The cell survival rate of control group, CeO2+H2O group and H2O2group was measured by MTT method, respectively. The antioxidative protection of CeO2to the PC12 damaged by H2O2was evaluated. Results The size of nanoceria was 5-10 nm. According to the results of MTT method, it was shown that the cell survival rate of H2O2group was (74.61±3.97)%. And the cell survival rate of CeO2+H2O group was (99.21±4.01)%, which was significantly higher than H2O2group (P<0.05). Conclusion Nanoceria would have the protective effect on the PC12 which was oxidative damaged by H2O2.

nanoceria; preparation; PC12 cells; antioxidative damage

10.11724/jdmu.2015.06.02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31100772)；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2015)

劉純青(1975-)，女，遼寧大連人，副教授。E-mail：liuchunqing2008@hotmail.com

劉 娜，副教授。E-mail：1619205853@qq.com

TQ462+91

A

1671-7295(2015)06-0526-03

劉純青，申林林，欒藝，等. CeO2的制備、表征及對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,37(6)：526-528.

2015-07-17;

2015-10-20)