王艷，趙應(yīng)征，唐琴琴

（1.浙江省中醫(yī)院 西藥房，浙江 杭州 310006；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

肝素-泊洛沙姆超聲微泡體外溶栓實(shí)驗(yàn)

王艷1，趙應(yīng)征2，唐琴琴2

（1.浙江省中醫(yī)院 西藥房，浙江 杭州 310006；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

目的：探討治療性超聲（US）介導(dǎo)結(jié)合肝素-泊洛沙姆（HP）的微泡（MB）對(duì)自制體外血栓的溶解作用及機(jī)制。方法：對(duì)兔耳緣靜脈進(jìn)行取血，制備體外血栓，通過(guò)考察不同栓齡、超聲聲強(qiáng)（凈強(qiáng)度2～8 W/cm2）、作用時(shí)間和材料濃度下的栓溶率來(lái)確定各組的溶栓效應(yīng)，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。實(shí)驗(yàn)分組為：①US組；②US+MB組；③HP組；④US+HP組；⑤US+MB+HP組。結(jié)果：US+MB+HP組超聲所需時(shí)間最短，溶栓效果最好，而其余各組對(duì)于體外血栓也有一定溶解作用。結(jié)論：新合成的材料HP與超聲微泡聯(lián)合應(yīng)用后溶栓效果明顯提高，其在臨床治療血栓性疾病中具有較好的應(yīng)用潛力。

肝素-泊洛沙姆；超聲；微泡；溶栓

自1976年Trubestein等［1］首次使用血管內(nèi)高頻超聲溶解血栓獲得成功以來(lái)，超聲溶栓成為生物醫(yī)學(xué)超聲領(lǐng)域的重要研究課題。研究發(fā)現(xiàn)高能低頻超聲波能裂解體內(nèi)外動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和血栓［2］，栓溶率隨著血栓凝齡增加而降低［3］。利用微泡作造影劑，超聲可以監(jiān)測(cè)病變局部的血流異常。利用超聲波的照射作用，將微泡造影劑作為攜帶藥物或治療性基因的載體，可以實(shí)現(xiàn)藥物的靶向?qū)?，達(dá)到有效、快速、減少溶栓藥劑量以及減輕或避免不良反應(yīng)的作用。因此，超聲微泡藥物運(yùn)載系統(tǒng)在溶栓治療方面具有深遠(yuǎn)的前景。國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)超聲微泡具有血栓助溶作用，這種助溶作用一方面表現(xiàn)在微泡能夠有效增強(qiáng)超聲的溶栓作用，另一方面則表現(xiàn)在微泡可以增加溶栓藥物的作用，這就顯示出了超聲微泡聯(lián)合溶栓藥物治療方法的強(qiáng)力優(yōu)勢(shì)［4-5］。

本研究采用新合成的材料肝素-泊洛沙姆（HP），在前期已探討的該材料性質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過(guò)進(jìn)行體外自制血栓來(lái)進(jìn)一步考察HP對(duì)血栓的作用，同時(shí)摸索HP結(jié)合超聲增強(qiáng)溶栓效果的一些參數(shù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年新西蘭大白兔12只，雄雌不限，體質(zhì)量1.8～2.5 kg，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2材料和儀器 肝素（批號(hào)：080311，效價(jià)：105.1 AxaIU/mg，河南常山生化藥業(yè)有限公司）；HP（由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供）；泊洛沙姆（批號(hào)：WPWA544C，德國(guó)BASF，進(jìn)口分裝）；0.9%氯化鈉溶液（浙江康樂(lè)藥業(yè)）；MB（批號(hào)：090806E，由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供）；醫(yī)用超聲耦合劑（KL-250型，由溫州醫(yī)科大學(xué)院附屬第二醫(yī)院超聲科提供）；氯化鈣（AR，北京化工廠）；超聲儀（型號(hào)：K-628A）；電熱恒溫振蕩水槽（DKZ-450B型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；超聲探頭；24孔板；20 mL針筒；試管；刀片；秒表；EP管；移液槍。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1體外血栓的制備：對(duì)兔耳緣靜脈進(jìn)行采血置于EP管中，放入37 ℃恒溫水浴箱中，靜置一段時(shí)間，形成血凝塊后，用0.9%氯化鈉溶液沖洗3～4次，基本洗去附著的未凝血細(xì)胞，濾紙吸干，即得。

①栓徑的選擇：采用2、5、8 mm規(guī)格的模具制備了3種大小的血栓，通過(guò)幾次實(shí)驗(yàn)，綜合考慮操作的便利性與栓徑變化的確切性，我們最終選擇栓徑大小為5 mm規(guī)格的血栓。

②栓齡的考察：根據(jù)體外血栓的制備方法，采取靜置時(shí)間分別為4、5、6、8、12、24、36、48、60 h，制備相應(yīng)栓齡的血栓，考察超聲對(duì)不同栓齡血栓的消溶作用，確定合適的栓齡范圍。

1.3.2超聲溶栓技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化：①超聲強(qiáng)度對(duì)栓塊的溶解：采用的超聲儀探頭面積為5 cm2，波輸出方式為脈沖，考察時(shí)間為5 min，超聲強(qiáng)度在2～8 W/cm2之間。超聲方法：將裝有0.9%氯化鈉溶液及血凝塊的24孔板置于37 ℃恒溫水槽中距液面約0.5 cm左右，保證板底無(wú)氣泡，使24孔板接受超聲作用，探頭表面置于各血栓處的孔板底部。設(shè)定超聲聲強(qiáng)為8、7、6、5、4、3、2 W/cm2，作用時(shí)間為5 min。然后取出孔板，將多余液體吸出，測(cè)栓徑，繼而計(jì)算栓徑的改變量。每個(gè)超聲強(qiáng)度重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，記錄每個(gè)栓徑值，取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，用平均值對(duì)超聲強(qiáng)度作圖。②不同超聲強(qiáng)度在不同時(shí)間里對(duì)血栓的溶解：先制備相同栓齡及體積的血栓，置于37 ℃ 0.9%氯化鈉溶液中進(jìn)行超聲脈沖式照射，超聲強(qiáng)度為2、3、4 W/cm2時(shí)，觀察不同時(shí)間（1、2、3、5 min時(shí)）超聲對(duì)栓徑的影響，對(duì)應(yīng)每個(gè)時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，記錄栓徑，并計(jì)算平均值，以該值與時(shí)間及超聲強(qiáng)度作圖，從而評(píng)價(jià)溶栓效果。③MB濃度對(duì)溶栓的影響：參考1.3.1制備相同栓齡及體積的血栓，并將其置于裝有0.9%氯化鈉溶液的24孔板中，然后設(shè)定超聲時(shí)間為1 min，超聲強(qiáng)度為3 W/cm2，超聲脈沖式照射，比較不同MB體積對(duì)栓塊的溶解效果。④藥物加入量對(duì)溶栓的影響：參考1.3.1制備相同栓齡及體積的血栓，并將其置于裝有0.9%氯化鈉溶液的24孔板中，然后設(shè)定超聲時(shí)間為1 min，超聲強(qiáng)度為3 W/cm2，加入MB體積為0.2 mL，比較不同藥物加入量對(duì)栓塊的溶解效果。

1.3.3HP相關(guān)性質(zhì)的考察：①HP的溶解性：泊洛沙姆是一類(lèi)表面活性劑，由聚氧乙烯和聚氧丙烯聚合而成，其具有一定的溶解度，能溶于水，它能增加肝素的溶解度，增加與血栓的親和力。取少量HP，用少量0.9%氯化鈉溶液溶解，即成澄清溶液。②HP使用濃度的摸索：根據(jù)公式HP的濃度=（0.045× t-0.055）μmoL/mL計(jì)算即得。其中t為不加藥物所得的復(fù)鈣化時(shí)間。③肝素修飾化脂質(zhì)微泡凍干粉的制備：將氫化磷脂、泊洛沙姆、HP等材料按照一定比例在有機(jī)相中均勻分散，凍干（充入SF6氣體），得到肝素修飾化脂質(zhì)微泡凍干粉（白色，疏松粉末狀）。由于存在親水基團(tuán)，復(fù)溶性較好。鏡檢：粒徑不太均勻、存在部分異形泡、少量聚集，平均粒徑（2.58±0.26）μm，平均數(shù)量（1.7±0.26）×108/mL，無(wú)磷脂碎屑。MB粒徑受體內(nèi)外條件的影響較小，助溶效果比較好［6-7］。

1.3.4不同干擾因素對(duì)血栓栓溶率的影響：設(shè)置超聲強(qiáng)度為3 W/cm2，超聲時(shí)間為1 min，微泡加入體積為0.2 mL，在HP的體積為0.4 mL的條件下，考察不同干擾因素對(duì)栓溶率的影響。

1.3.5復(fù)鈣化時(shí)間實(shí)驗(yàn)：用0.9%氯化鈉溶液分別配置一定溶度的泊洛沙姆、HP、肝素溶液。各取3只試管溶液，分別加入血漿0.2 mL，CaCl2溶液（濃度為0.025 mol/L）0.2 mL，置于37 ℃水浴恒溫，記錄試管內(nèi)出現(xiàn)第一條絲纖狀物的時(shí)間，計(jì)算平均值。根據(jù)該數(shù)值，由公式HP的濃度=（0.045×t-0.055）μmoL/mL，計(jì)算所需HP濃度。

1.3.6HP的血液相容性：采用Lee-White實(shí)驗(yàn)（全血凝血實(shí)驗(yàn)），取潔凈玻璃試管分為3組，分別為泊洛沙姆組、HP組、肝素組，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)37 ℃水浴恒溫后，依次沿壁加入1 mL兔血于試管中，開(kāi)始計(jì)時(shí)。3 min后每隔30 s傾斜試管，至試管中血液不流動(dòng)計(jì)為凝血時(shí)間。

2　結(jié)果

2.1栓齡與血栓栓溶率的關(guān)系 如圖1所示，超聲栓溶率在4～60 h范圍內(nèi)的趨勢(shì)是隨著栓齡的增加而降低，且在6 h以內(nèi)超聲溶解血栓的效果最佳。結(jié)果表明臨床治療栓塞性疾病應(yīng)該越早治療，效果越好。

圖1　栓齡和血栓溶栓率關(guān)系圖

2.2不同超聲強(qiáng)度對(duì)栓塊溶解的效果 如圖2所示，在超聲強(qiáng)度2～8 W/cm2范圍內(nèi)，隨著超聲強(qiáng)度的增加，栓徑大小呈現(xiàn)減小的現(xiàn)象。強(qiáng)度越大，栓溶作用越明顯。

圖2　超聲強(qiáng)度和栓徑關(guān)系圖

2.3超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間對(duì)溶栓的影響 不同超聲強(qiáng)度（2、3、4 W/cm2）和不同超聲時(shí)間（1、2、3、5 min）對(duì)血栓溶解的效果如圖3所示，血栓栓徑與超聲強(qiáng)度或超聲時(shí)間成反比，超聲強(qiáng)度越大或超聲時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于血栓的溶解。

圖3　超聲時(shí)間和栓徑相互關(guān)系圖

2.4微泡的加入對(duì)溶栓效果的影響 設(shè)定超聲時(shí)間為1 min，超聲強(qiáng)度為3 W/cm2，比較不同微泡體積對(duì)栓塊的溶解效果。如圖4所示，在一定的體積范圍內(nèi)（0～0.2 mL），隨著微泡體積增大，栓溶增加。但當(dāng)達(dá)到一定體積后，栓溶變化不明顯。

圖4　不同微泡溶度與栓徑相互關(guān)系圖

2.5藥物HP的加入對(duì)溶栓的影響 超聲時(shí)間為1 min，超聲強(qiáng)度為3 W/cm2，微泡體積為0.2 mL，比較不同量的HP加入對(duì)栓塊的溶解效果。如圖5所示，在一定HP加入量范圍內(nèi)（0～0.5 mL），隨HP加入量增大，栓溶作用增加。

圖5　不同HP加入量與栓徑相互關(guān)系圖

2.6不同干擾因素對(duì)栓溶率的影響 如表1和圖6所示，超聲微泡聯(lián)合HP的栓溶作用最強(qiáng)，超聲與HP均具有一定程度的栓溶作用，微泡能增加超聲的栓溶作用。

圖6　體外溶栓效果圖

2.7 復(fù)鈣化結(jié)果 不加藥物的試管出現(xiàn)第一條絲狀物的時(shí)間為t1=11′03′，代入公式計(jì)算：HP溶度= （0.0045×t1-0.055）μmoL/mL

由上式計(jì)算得到HP溶度為2.9 μmoL/mL。復(fù)鈣化時(shí)間見(jiàn)表2，肝素組t2=16′04′，HP組平均時(shí)間t3= 19′42′，泊洛沙姆組平均時(shí)間t4=14′30′。HP對(duì)血栓形成有一定的抑制作用。

表1　不同干擾因素對(duì)栓溶率的影響（%）

表2　復(fù)鈣化時(shí)間記錄表

2.8全血凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如表3所示，HP組的血液相容性比較好，能延緩血栓的形成。

表3　全血凝血時(shí)間記錄表（min）

3　討論

本研究所選血栓模型制備過(guò)程與已有報(bào)道結(jié)果基本相似。我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及條件選用靜置凝血時(shí)間為5 h，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中證實(shí)該時(shí)間所形成的血凝塊穩(wěn)定，適合本實(shí)驗(yàn)。

超聲波自身的生物物理特性使其不僅在診斷領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在治療領(lǐng)域也展示出令人鼓舞的應(yīng)用前景。本研究以不同超聲強(qiáng)度、不同照射時(shí)間的超聲波輻照體外血栓，有明確的溶栓效果，這與以往國(guó)內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符［8-9］。大多數(shù)研究者認(rèn)為超聲溶栓可能與超聲波空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)有關(guān)，而與其熱效應(yīng)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)［10］。超聲波在組織和細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生空化現(xiàn)象，可引發(fā)高達(dá)1～3個(gè)大氣壓的“內(nèi)爆炸”效應(yīng)，足以使血栓在極短的時(shí)間內(nèi)碎解成細(xì)小的顆粒。此外，Porter等［11］的實(shí)驗(yàn)證明，超聲波能使纖維蛋白分解產(chǎn)物D-二聚體增加，推測(cè)其可以增強(qiáng)纖維蛋白溶解。

研究中還涉及在固定超聲和照射時(shí)間的條件下，對(duì)不同栓齡的血栓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得溶栓結(jié)果與栓齡成反比，即栓齡越高，栓溶率則呈下降趨勢(shì)，這與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。因此，在安全能量范圍內(nèi)，尋求超聲的最佳溶栓效果已成為近年來(lái)研究的重點(diǎn)。在考察超聲強(qiáng)度對(duì)栓溶影響的實(shí)驗(yàn)中，我們選擇超聲強(qiáng)度范圍為2～8 W/cm2。這是基于通過(guò)排除最大值和最小值，在較平穩(wěn)的范圍內(nèi)更好地考察變量，減少誤差［12］。在考察超聲時(shí)間對(duì)栓溶影響實(shí)驗(yàn)中，綜合臨床治療栓塞性疾病中對(duì)時(shí)間要求的嚴(yán)格性，我們考察了0～6 min內(nèi)超聲的栓溶效果。在考察完超聲參數(shù)后，我們研究了新材料HP對(duì)栓溶的影響，以及在超聲系數(shù)的改變對(duì)栓溶促進(jìn)作用影響不大的情況下，加入不同體積的微泡，栓溶作用發(fā)生改變，進(jìn)而說(shuō)明微泡能增加超聲的栓溶作用。我們綜合考察了超聲微泡和HP的相互作用，并發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)用，溶栓效果最佳，其原因可能是空化作用后使血栓破裂的同時(shí)增加了HP與血栓的接觸面積，進(jìn)而使栓溶作用進(jìn)一步增加?？傊?，超聲具有一定的溶栓效應(yīng)，超聲微泡聯(lián)合HP，在溶栓方面有協(xié)同作用，即強(qiáng)化HP溶栓效應(yīng)，并可減少有效溶栓的HP劑量，從而減少大劑量溶栓藥物導(dǎo)致致命性出血并發(fā)癥的危險(xiǎn)性。HP超聲微泡溶栓較單一溶栓藥物治療效果好［13］。隨著微泡制造技術(shù)的發(fā)展，HP超聲溶栓有望成為急性血管栓塞性疾病高效、無(wú)創(chuàng)的治療手段。

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（本文編輯：吳昔昔）

Ultrasound-microbubble mediated heparin-poloxamer thrombolysis study in vitro

WANG Yan1， ZHAO Yingzheng2， TANG Qinqin2.
1.Department of Pharmacy， Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhejiang，Hangzhou， 310006； 2.School of Pharmacy， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035

Objective: To explore and discuss the mechanism of theapeutical ultrasound combined with heparin-poloxamer （HP） on thrombus dissolution in vitro. Methods: Blood clots were prepared from rabbit ear blood. Main factors on the thrombolysis effects in vitro were investigated， including blood clot age， ultrasonic intensity （pure intensity seted in the range of 2～8 W/cm2）， ultrasound time and material concentration. Five experimental groups were as follows: ①US； ②US+MB； ③HP； ④US+HP； ⑤US+MB+HP. Through the results of the experiment， thrombolysis effect in each group was determined and the mechanism was discussed. Results: The group （US+MB+HP） showed the best result in the thrombolysis with less ultrasound time， though the other groups showed certain thrombosis effects in vitro. Conclusion: Heparin-poloxamer combined with ultrasound microbubble has an improved effect in thrombolysis， which may be a potential technique for clinical treatment of thrombotic diseases.

heparin-poloxamer； ultrasound； microbubbles； thrombolysis

R94

B DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.011

2015-01-12

王艷（1987-），女，浙江建德人，初級(jí)藥師。

趙應(yīng)征，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：pharmtds@163. com。