周益飛，王照亮，張瑜，陳琴，鄭翔，佟笑，3，黃益燈，3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)溫州第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)溫州第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325000；3.溫州解放軍第118醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325000）

趨化因子CXCL14在鼻咽癌組織中的表達及其臨床意義

周益飛1，王照亮1，張瑜1，陳琴1，鄭翔2，佟笑1，3，黃益燈1，3

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)溫州第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)溫州第三臨床學(xué)院 溫州市人民醫(yī)院 病理科，浙江 溫州 325000；3.溫州解放軍第118醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325000）

目的：分析趨化因子CXCL14在鼻咽癌組織中的表達，并探討其臨床意義。方法：采集30例鼻咽癌患者（鼻咽癌組）及30例鼻咽炎患者（正常對照組）鼻咽部組織，采用實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)方法進行CXCL14表達的檢測。結(jié)果：CXCL14 mRNA和蛋白水平在鼻咽癌組的表達較正常對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。臨床相關(guān)性分析表明，CXCL14表達的下調(diào)與腫瘤T分級（P=0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.028）及臨床分期（P=0.001）相關(guān)。結(jié)論：鼻咽癌組織中CXCL14 mRNA和蛋白水平表達下降，CXCL14可能參與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

趨化因子CXCL14；鼻咽腫瘤；鼻咽炎；免疫組織化學(xué)

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是臨床常見的頭頸部惡性腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)以中國東南部和東南亞地區(qū)高發(fā)，我國的鼻咽癌患者占全世界鼻咽癌患者總數(shù)的80%［1］。70%的NPC患者確診時已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，鼻咽癌的治療方法主要是同期放化療及綜合治療，但仍有20%～30%患者治療失敗，局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是治療失敗的主要原因［2］。目前認為腫瘤微環(huán)境的細胞能分泌一些趨化因子，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。CXCL14是趨化因子CXC家族的一個新成員。有研究發(fā)現(xiàn)，CXCL14具有獨特的生物學(xué)作用，能抑制肺癌和胃癌細胞，而促進卵巢癌和前列腺癌細胞的侵襲［3］。然而，CXCL14在NPC的研究仍較少，因此，本研究著重探討CXCL14 mRNA和蛋白在NPC組織中的表達及其臨床意義。

1　資料和方法

1.1一般資料 本組30例來自2012年12月至2014 年10月在溫州市人民醫(yī)院門診行鼻內(nèi)鏡下鼻咽活檢確診的NPC患者（鼻咽癌組），所有患者均為初發(fā)患者，未進行過化療和放療，排除其他器官腫瘤。鼻咽癌組患者中男22例，女8例，年齡13～83歲，平均（46.9±17.2）歲。NPC的組織病理學(xué)診斷由醫(yī)院病理科根據(jù)1991年世界衛(wèi)生組織鼻咽癌組織學(xué)分類標(biāo)準診斷：鱗狀細胞癌7例，非角化性癌23例。臨床TNM分期采用2010國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第7版確定：T1期10例，T2期9例，T3期9例，T4期2例；N0期10例，N1期13例，N2期5例，N3期2例；無M1期患者。同時選擇同期在本院進行鼻內(nèi)鏡下鼻咽活檢確診為鼻咽部慢性炎癥患者30例作為正常對照組，其中男18例，女12例，年齡18～91歲，平均（46.3±18.4）歲。2組患者的年齡和性別比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），活檢前均進行術(shù)前告知并簽署知情同意書，所有入組病例均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意及批準。

1.2方法

1.2.1試劑和儀器：主要試劑：Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；DNase I和DEPC處理水購自寶生物工程（大連）有限公司；ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Master Mix購自日本Toyobo公司；CXCL14特異性抗體I抗購自美國Abcan公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔I I抗、羊血清封閉液和DAB顯色液購自北京中杉金橋生物公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。主要儀器：實時定量PCR儀（美國Bio-Rod CFX96），熒光顯微鏡（日本Nikon Eclipse Ci-L）。

1.2.2組織標(biāo)本采集及處理：鼻內(nèi)鏡下切取鼻咽部組織，分為二部分：一部分樣本在離體后30 min，采用液氮冷凍保存，以備RNA的提??；其余組織由4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，進行免疫組織化學(xué)檢測。1.2.3 RNA的分離純化：總RNA提取參照Trizol試劑說明書進行。為去除可能污染的DNA，抽提RNA經(jīng)DNase I處理后，酚-氯仿抽提，純化的RNA以DEPC水溶解，用紫外分光光度計檢測RNA濃度后，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4CXCL14 mRNA檢測：參照ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1 μL提取的RNA以O(shè)ligo（dT）進行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，75 ℃15 min，反應(yīng)結(jié)束后-20 ℃保存。以15 μL反應(yīng)體系進行實時定量熒光PCR（real-time PCR）。相關(guān)分析的引物序列見表1。反應(yīng)體系包括：1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，1×SYBR Green I MasterMix，0.5 μmol/L特異前向引物，0.5 μmol/L特異反向引物。反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。使用Bio-Rod CFX96儀器進行。所有樣品做3復(fù)孔。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，采用相對定量法，以2-ΔΔCt表示標(biāo)本中CXCL14相對表達量，其中ΔΔCt= （CtCXCL14-CtGAPDH）腫瘤-（CtCXCL14-CtGAPDH）正常。

表1　引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測：將鼻咽癌組織及鼻咽炎組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋后進行4 μm連續(xù)切片，玻片經(jīng)0.1%多聚-L-賴氨酸處理；二甲苯脫蠟至蒸餾水。用0.3%過氧化氫室溫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；PBS（0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）洗滌3次；枸櫞酸鹽緩沖液高壓1.5 min進行抗原修復(fù)。自然冷卻至室溫后，PBS洗滌3次；羊血清封閉2 h；加入I抗，4 ℃過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔I I抗，37 ℃，孵育30 min；DAB顯色。蘇木精復(fù)染、1%鹽酸乙醇分化、1%氨水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯脫水透明后，中性樹膠封片。設(shè)陰性對照組以0.01 mol/L PBS代替I抗。CXCL14定位于胞漿，胞漿顯色呈棕色為陽性表達；用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件計算平均吸光度值，并進行統(tǒng)計分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 19統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性等條件以±s表示，2組定量資料比較采用兩獨立樣本比較的t檢驗，兩個定量變量之間的相關(guān)性分析視情況采用直線相關(guān)或秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1鼻咽癌組織CXCL14 mRNA的表達 如圖1所示，GAPDH和CXCL14的熔解曲線均為單峰，表明我們建立的real-time PCR方法能夠特異性擴增目的基因。鼻咽癌組織CXCL14 mRNA的相對表達結(jié)果如圖2所示，腫瘤樣本的CXCL14 mRNA相對表達值為0.51 （0.31，0.68），明顯低于正常對照組（P＜0.001）。

圖1　CXCL14和GAPDH的熔解曲線

圖2　鼻咽癌組織CXCL14 mRNA相對表達水平

2.2鼻咽癌組織CXCL14蛋白表達的免疫組織化學(xué)分析 鼻咽癌組織與鼻咽炎組織的CXCL14蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖3。CXCL14蛋白表達在胞漿，正常組織的CXCL14蛋白表達呈強陽性、棕色染色（見圖3A），而腫瘤組織CXCL14蛋白表達低或幾乎無表達（見圖3B）。對免疫組織化學(xué)結(jié)果采用半定量分析，結(jié)果表明鼻咽癌組及正常對照組CXCL14蛋白的平均光密度值分別為0.076±0.033和0.231±0.064（見圖4）。統(tǒng)計分析顯示，鼻咽癌組樣本的CXCL14蛋白表達水平低于正常對照組（t=11.83，P＜0.001）。

圖3　鼻咽炎組織和鼻咽癌組織CXCLl4蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（× 200）

圖4　鼻咽癌組和正常對照組CXCLl4蛋白表達的比較

2.3CXCL14蛋白表達水平與鼻咽癌臨床病理特征相關(guān)性 結(jié)果顯示，不同腫瘤T分期、不同臨床分期的患者CXCL蛋白的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者之間差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。屬T3、T4的鼻咽癌腫瘤組織CXCL14的相對表達量明顯低于T1、T2患者（P=0.002），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌腫瘤組織CXCL14的相對表達量也低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織（P=0.028）。臨床分期屬I I I期、IV期的鼻咽癌組織CXCL14的相對表達量也明顯低于臨床分期屬I期、I I期的標(biāo)本（P=0.002）。不同年齡分組、不同性別和不同病理類型的腫瘤患者CXCL14蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

進一步對年齡與鼻咽癌腫瘤組織CXCLl4表達水平進行直線相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，r=0.129，P=0.496；對腫瘤T分期（T1、T2、T3、T4）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0、N1、N2、N3）、臨床分期（I、I I、I I I、IV期）與鼻咽癌腫瘤組織CXCLl4表達水平進行秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示，等級相關(guān)系數(shù)rs（P值）依次為-0.556（0.001）、-0.402（0.028）和-0.627（0.001），提示原發(fā)腫瘤越大、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍越大、臨床分期越晚，CXCL14表達越低。

表2　不同臨床特征的鼻咽癌患者CXCL14蛋白表達水平的比較

3　討論

趨化因子是一類由多種細胞產(chǎn)生的分子量在8～12 kD、能趨化細胞發(fā)生定向移動的細胞因子，具有趨化白細胞黏附和遷移、免疫監(jiān)視、創(chuàng)傷修復(fù)等功能，而且在影響血管增殖、器官形成、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮廣泛的生理和病理作用［4］。CXCL14是較晚發(fā)現(xiàn)的趨化因子CXC家族成員，又稱為BRAK、BMAC和MIP-2γ，1999年由Hromas等［5］從人類乳腺和腎臟組織中分離克隆。CXCL14蛋白前體含99個氨基酸，成熟的CXCL14蛋白含77個氨基酸，定位于人染色體5p31.1［6］。研究表明CXCL14 mRNA在正常組織中有表達，以表皮、腎臟、小腸和肝臟的表達水平最高［7］。CXCL14具有促進樹突狀細胞、自然殺傷細胞募集，能抑制腫瘤新生血管形成，趨化活化B細胞、單核-巨噬細胞，抑制早期妊娠中滋養(yǎng)層細胞浸潤等多種功能［8］，還參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究顯示，CXCL14在不同類型腫瘤表達存在異質(zhì)性。Wikman等［9］發(fā)現(xiàn)在發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞中，CXCL14基因表達下降。胃癌組織中CXCL14的表達明顯低于其癌旁正常組織［10］。而在浸潤性胰腺癌和前列腺癌細胞中，CXCL14蛋白明顯增加［11］。但不同研究者對結(jié)直腸癌組織CXCLl4表達的檢測結(jié)果報道不一致。Cao等［12］報道，CXCLl4 mRNA在結(jié)腸癌組織中表達下調(diào)，而Zeng等［13］的結(jié)果卻與之相反，Lin等［14］進一步分析顯示腫瘤組織CXCLl4表達水平與結(jié)直腸癌患者生存時間呈正相關(guān)。

研究顯示，在頭頸部鱗狀細胞癌組織中CXCL14的表達減少。Ozawa等［15］發(fā)現(xiàn)CXCL14在口腔鱗狀細胞癌細胞中表達明顯降低，用CXCL14表達載體轉(zhuǎn)染無胸腺裸鼠，口腔鱗癌的形成減弱。目前，CXCL14在鼻咽癌中的表達情況鮮見相關(guān)報道。為分析CXCL14表達與鼻咽癌的相關(guān)性，本研究通過實時熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)檢測鼻咽癌腫瘤組織和鼻咽炎組織CXCL14 mRNA及蛋白表達水平，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)CXCL14在鼻咽癌組織中的表達明顯低于相對照的鼻咽炎組織。這與此前的頭頸部鱗癌相關(guān)研究［15］報道一致。進一步分析CXCL14蛋白表達與鼻咽癌臨床特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)屬T3、T4的鼻咽癌腫瘤組織CXCL14的相對表達量明顯低于T1、T2，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織CXCL14表達也低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織；臨床分期屬I I I、IV期的鼻咽癌組織CXCL14的相對表達量也明顯低于臨床分期屬I、I I期的組織。相關(guān)分析表明，腫瘤T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期、臨床分期與鼻咽癌腫瘤組織CXCLl4表達水平有顯著相關(guān)性，CXCL14表達水平與鼻咽癌患者性別、年齡、病理類型等無統(tǒng)計學(xué)意義。這提示CXCL14是判斷鼻咽癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。Ito等［16］在無胸腺裸鼠模型的實驗表明，口腔鱗狀上皮癌細胞中CXCL14的過量表達能使腫瘤細胞的大小和數(shù)量受到抑制。進一步的實驗證實，CXCL14可能通過自然殺傷細胞和腫瘤干細胞的相互作用抑制腫瘤微血管形成，從而抑制腫瘤的進展［17］。Rho激酶抑制劑法舒地爾（Fasudil）通過誘導(dǎo)頭頸部鱗癌細胞系CXCL14基因表達抑制小鼠腫瘤的生長［18］。這證明CXCL14能抑制頭頸部鱗狀細胞癌的增殖和遷移，是一個潛在的分子治療靶點。

綜上所述，CXCL14 mRNA及蛋白表達在NPC組織明顯低于鼻咽炎組織，且與鼻咽癌T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，趨化因子CXCL14可能參與了鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展進程。檢測鼻咽癌組織CXCL14 mRNA及蛋白表達水平可作為鼻咽癌患者預(yù)后評價的臨床輔助指標(biāo)，趨化因子及其受體拮抗劑在將來可能成為鼻咽癌放化療后的輔助治療藥物。

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（本文編輯：胡苗苗）

Expression and clinical significance of chemokine CXCL14 in nasopharyngeal carcinoma

ZHOU Yifei1，WANG Zhaoliang1， ZHANG Yu1， CHEN Qin1， ZHENG Xiang2， TONG Xiao1，3， HUANG Yideng1，3.
1.Department of Otorhinolaryngology， the Wenzhou Third Clinical Institute Affiliated to Wenzhou Medical University， Wenzhou People’s Hospital ，Wenzhou， 325000； 2.Department of Pathology， the Wenzhou Third Clinical Institute Affiliated to Wenzhou Medical University， Wenzhou People’s Hospital， Wenzhou， 325000； 3.Department of Otorhinolaryngology， the No.118 Hospital of PLA， Wenzhou， 325000

Objective: To investigate the expression of chemokine CXCLl4 and its clinical significance in nasopharyngeal cancer （NPC）. Methods: Thirty patients with NPC were selected as the disease group and another 30 cases with nasopharyngitis as control group. Biopsy with nasopharyngeal tissue was performed. The CXCLl4 expression was detected with real-time fluorescence quantitative PCR and immunohistochemistry. Results: The CXCLl4 expression with NPC tissues in mRNA and protein levels declined compared with the control group （P＜0.001）. Correlative analysis showed the dow-nregulation of CXCLl4 expression in protein levels with NPC tissues was associated with T classification of tumor （P=0.001）， lymph node metastasis （P=0.028） and the clinical stage （P=0.001）. Conclusion: It is possible that CXCLl4 plays a role in the development and progression of NPC.

chemokine CXCLl4； nasopharyngeal neoplasm； nasopharyngitis； immunohistochemistry

R994.6

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.009

2015-08-09

周益飛（1975-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，在職碩士生。

黃益燈，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：huang_yideng@126.com。