周璇，王哲，李軍偉，朱光輝

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

超高效液相色譜法測定白酒中鄰苯二甲酸酯的濃度

周璇1，王哲1，李軍偉2，朱光輝1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

目的：建立超高效液相色譜（UPLC）法測定白酒中鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的方法。方法：采用固相萃取柱提取白酒中的塑化劑，使用超高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，流動相為乙腈-水，流速為0.40 mL/min，檢測波長為224 nm。結(jié)果：本方法線性關(guān)系良好，日內(nèi)、日間精密度均＜15%，加標(biāo)回收率為90.08%～103.32%。最低檢測限為1 μg/mL。5種不同品牌白酒均含有DEHP。結(jié)論：UPLC適合于白酒中塑化劑的檢測。

塑化劑；鄰苯二甲酸酯；超高效液相色譜；固相萃??；白酒

塑化劑也稱作增塑劑，是2011年臺灣“起云劑”食品安全事件的主角之一［1］。此后，在方便食品、飲料及藥物方面不斷被曝出塑化劑超標(biāo)，后有報告酒鬼酒也被檢測出塑化劑成分鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）［2］。長期的塑化劑攝入對人體有嚴(yán)重的危害［3］，不但對人體免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖發(fā)育器官等有害，甚至?xí)禄?、癌變和突變。?jù)報道稱，市場上不止酒鬼酒查出含塑化劑，為了解其他品牌白酒是否有塑化劑超標(biāo)的情況，本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法對5種知名品牌白酒進(jìn)行檢測。

1　材料和方法

1.1儀器和設(shè)備 BS210S型電子分析天平（北京賽多斯儀器公司）；UPLC液相色譜儀（Waters）；渦旋混合器XW-80A（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；離心機(jī)TGL-16G（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BF2000氮?dú)獯蹈蓛x（北京八方世紀(jì)科技有限公司）；Supelco Vacuum Manifold固相萃取裝置（上海析友分析儀器有限公司）；ProElut PSA玻璃SPE固相萃取柱［2］（迪馬科技有限公司）；MassLynx Version 4.1數(shù)據(jù)分析軟件（Waters）。

1.2材料和試劑 DEHP（含量99%，上海希格瑪高技術(shù)有限公司）；正己烷分析純（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；甲醇色譜純（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；丙酮分析純（中國上海試劑總廠）；乙腈色譜純（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）。知名品牌白酒甲、乙、丙、丁、戊各2個批次，依次編號為1～10號。

1.3實(shí)驗方法

1.3.1色譜條件：流速0.40 mL/min，固定相：Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相∶乙腈∶水=60∶40；檢測波長：224 nm。流動相的梯度洗脫情況見表1。

表1　流動相的梯度洗脫時間與比例

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取DEHP 25 mg置于25 mL容量瓶中，加入正己烷稀釋至刻度，充分搖勻，配制濃度為1.0 mg/L的DEHP的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。實(shí)驗中的容量瓶、試管、離心管等均以丙酮浸泡30 min并清洗，以減少實(shí)驗過程中DEHP的帶入干擾。

1.3.3樣品處理：①樣品前處理：分別稱取樣品1 mL置于玻璃離心管中，加入正己烷1 mL，渦旋2 min，轉(zhuǎn)速不低于4 000 r/min離心1 min，將上清液移至潔凈的試管中。再加入正己烷重復(fù)提取2次，合并3次上清液，在40 ℃下氮?dú)獯抵? mL。②SPE［4］柱凈化：依次加入丙酮5 mL、正己烷5 mL，棄去流出液（含水樣品在活化前向SPE柱中加入1 g無水硫酸鈉）。將待凈化液加入SPE柱，且將流速控制在1 mL/min內(nèi)。依次加入正己烷5 mL、4%丙酮-正己烷溶液5 mL，收集流出液。在40 ℃的緩慢氮?dú)饬鳁l件下吹至近干后揮干，乙腈定容至1 mL供檢測。

1.3.4相關(guān)值的測定：①專屬性：采用1.3.1的色譜條件，確定DEHP的保留時間。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：配制DEHP濃度分別為500.0、250.0、100.0、50.0、 25.0、10.0、5.0、2.5、1.0 μg/mL含50%乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)液各1 mL；同時，以不加入DEHP的含50%乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)液為空白對照，按1.3.3進(jìn)行操作，測定空白對照的面積為As0，其余濃度的DEHP面積為As，以As-As0為縱坐標(biāo)（y），以DEHP對應(yīng)各點(diǎn)濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制DEHP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。③精密度和回收率測定：配制低、中、高3種濃度（DEHP濃度為2.5、50、250 ng/mL）白酒標(biāo)準(zhǔn)液，配制后立刻進(jìn)行樣品處理，每個濃度進(jìn)行5個樣品分析，取得的面積再減去空白對照的峰面積，依據(jù)當(dāng)日各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算DEHP濃度，每個濃度測定5次，計算日間變異和日內(nèi)變異。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的DEHP濃度，同時加入標(biāo)準(zhǔn)品的劑量之比，計算加標(biāo)回收率。

2　結(jié)果

2.1專屬性的測定 在該實(shí)驗色譜條件下，DEHP的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品具有良好的分離效果，其中測得DEHP出峰保留時間為5.395 min，最低檢測濃度為1 μg/mL。見圖1-2。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制如1.3.4所述，在標(biāo)準(zhǔn)系列濃度范圍內(nèi)，DEHP呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，值均在0.99以上，方法線性關(guān)系良好。DEHP的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=7.78×103x-2.92×104（r= 0.999）。

2.3精密度和回收率的測定 DEHP的日內(nèi)、日間精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差均在15%以內(nèi)，加標(biāo)回收率為90.80%～103.32%，滿足定量分析要求。見表2。

2.4不同品牌白酒中DEHP的檢測結(jié)果 采用本實(shí)驗建立的方法，對5種白酒品牌中的DEHP的含量進(jìn)行了檢測，測得結(jié)果為2.19～3.33 μg/mL。見表3。

3　討論

圖1　標(biāo)準(zhǔn)品UPLC圖

本研究建立了UPLC對白酒中的DEHP進(jìn)行檢測，該方法具有良好的靈敏度、重復(fù)性，且操作簡便。由于白酒中本身可能含有微量的DEHP，因此在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時，應(yīng)消除白酒中原有的DEHP對標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的影響。

圖2　樣品UPLC圖

表2　白酒中DEHP的精密度和加標(biāo)回收率（n=5）

表3　5種品牌白酒中的DEHP的濃度（μg/mL）

目前出臺的GB/T21911-2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》國家標(biāo)準(zhǔn)以及以往報道的飲料酒水中增塑劑的檢測方法多采用液相萃取法［5］，本實(shí)驗參考已有研究［6-7］，采用固相萃取法，選取具有高效高選擇性的SPE固相柱，對樣品的塑化劑加以分離和富集，發(fā)現(xiàn)具有良好的分離效果、操作簡便、溶劑用量少等特點(diǎn)。相對于塑料萃取柱，采用玻璃SPE固相萃取柱減少了樣品處理中塑化劑的干擾。同時，固相萃取法具有回收率較高的特點(diǎn)，因此是一種理想的預(yù)處理方法。

在預(yù)實(shí)驗中，建立了同時檢測包含DEHP在內(nèi)的6種塑化劑的方法，6種塑化劑及其出峰保留時間分別為鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）0.78 min、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）2.62 min、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）3.57 min、鄰苯二甲酸二環(huán)己脂（DCHP）3.63 min、DEHP 5.39 min、鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）5.51 min。但實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，白酒樣品中都檢測出DEHP，部分樣品檢測出其他幾種塑化劑，由于DEHP在食品中常見，危害性大，因此，本研究主要對DEPH檢測方法進(jìn)行了研究。

5種品牌的白酒中均檢測出了DEHP，同時同品牌不同批次白酒的塑化劑含量也不同，這可能是由于白酒的釀制時間、地點(diǎn)以及器材、包裝等環(huán)節(jié)的不同所造成。雖然在白酒生產(chǎn)過程中的自身發(fā)酵環(huán)節(jié)不產(chǎn)生塑化劑，但是白酒的生產(chǎn)過程中會接觸大量的塑料成分，主要有塑料輸酒管、接酒桶，成品酒的內(nèi)蓋、桶、瓶、袋等塑料包裝，封酒缸塑料布等。塑化劑屬于酯類化合物，它的極性較大，且易溶于有機(jī)溶劑。白酒中乙醇濃度較高，容易使塑料制品中的塑化劑溶解進(jìn)入白酒，需引起人們的重視。

［1］郭永梅. 鄰苯二甲酸酯的毒性及相關(guān)限制法規(guī)［J］. 廣州化學(xué)， 2012， 37（2）: 75-79.

［2］伊雯. 塑化劑， 白酒里的鬼［J］. 食品與生活， 2012（12）: 19.

［3］高麗芳， 李勇， 蘇憶蘭， 等. 鄰苯二甲酸二-（2-乙基己基）酯對小鼠胚胎致畸作用和心肌細(xì)胞的毒性［J］. 毒理學(xué)雜志，2005， 19（2）: 123-124.

［4］李擁軍， 熊文明， 陳堅文， 等. 固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定羅非魚中9種鄰苯二甲酸酯［J］. 分析測試學(xué)報， 2012， 31（3）: 278-283.

［5］王龍， 黃嗣竣， 馬玉容， 等. 簡化高效液相色譜法檢測鄰苯二甲酸酯［J］. 中國測試， 2012， 38（3）: 5 2-54.

［6］史玉坤， 楊自力， 喻利娟， 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法測定飲料中鄰苯二甲酸酯類增塑劑［J］. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2011， 38（13）: 2547-2549.

［7］陳冰冰， 李軍偉， 陳欣欣， 等. 固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測飲料中的鄰苯二甲酸二酯［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013， 43（1）: 22-25.

（本文編輯：吳昔昔）

Determination of DEHP in white spirit by ultra performance liquid chromatography

ZHOU Xuan1， WANG Zhe1， LI Junwei2， ZHU Guanghui1.
1.Department of Pharmacy， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 2.School of Pharmacy， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035

Objective: To establish a method to determine the concentration of di （2-ethylhexyl） phte （DEHP） in white spirit and study the different concentration between the same brand and the different brands. Methods: DEHP was detected in a solid phase extraction-ultra performance liquid chromatography （SPE-UPLC）method. DEHP was extracted from white spirit， using solid phase extraction column， then detected with ultra high performance liquid chromatograph. The mobile phase was acetonitrile-water and the flow rate was 0.4 mL/min. The UV detection wavelength was 224 nm. Results: The linear relation was good in this method， the RSD was less than 15%， and the recovery was between 90.08% and 103.32%. The low limit of the detection was 1 μg/mL. The samples with five different bland were all contain DEHP. Conclusion: The method is compeletely suitable for determination of DEHP in white spirit.

di （2-ethylhexyl） phte； DEHP； ultra performance liquid chromatography； solid phase extraction；white spirit

·臨 床 經(jīng) 驗·

R917

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.008

2015-02-16

國家自然科學(xué)基金資助項目（81373032）；溫州市科技計劃項目（Y20130161）。

周璇（1980-），女，浙江溫州人，主管藥師。

朱光輝，主任藥師，Email：lcylhy@126.com。