洪廣亮，譚佳平，丁穎威，趙光舉，李萌芳，盧中秋

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

耐百草枯人肺腺癌細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性

洪廣亮，譚佳平，丁穎威，趙光舉，李萌芳，盧中秋

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 急診科，浙江 溫州 325015）

目的：建立耐百草枯（PQ）的人肺腺癌細(xì)胞株（A549/PQ），并初步研究其生物學(xué)特性。方法：采用濃度遞增誘導(dǎo)法建立A549/PQ，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，以乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測法、CCK-8法檢測A549/PQ和親本A549對PQ的敏感性，計(jì)算A549/PQ的半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥指數(shù)（RI），細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線和倍增時(shí)間，流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期。結(jié)果：光鏡下A549/PQ細(xì)胞變大、形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞間隙變大。PQ誘導(dǎo)A549/PQ細(xì)胞LDH釋放明顯低于其親本細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PQ誘導(dǎo)A549/PQ細(xì)胞IC50為1716.33 μmol/L明顯高于A549細(xì)胞的215.03 μmol/L（P＜0.05），RI為7.98。A549/PQ細(xì)胞倍增時(shí)間明顯高于A549細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A549/PQ細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少（P＜0.05）。結(jié)論：成功構(gòu)建對PQ耐藥的A549細(xì)胞，其生物學(xué)特征與親本細(xì)胞存在明顯差異，為PQ毒理機(jī)制研究提供了良好細(xì)胞模型。

百草枯；耐藥株；生物學(xué)特性

百草枯（Paraquat，PQ），化學(xué)名1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽離子鹽，是一種快速滅生性除草劑，在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。其對人畜有很強(qiáng)毒性，缺乏特效解毒劑，急性中毒病死率高達(dá)40%～80%［1］。PQ毒性可累及人體多個(gè)臟器，如肺、肝、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，其中肺是PQ中毒損害的最主要靶器官［2］。PQ在肺組織內(nèi)特異性蓄積是造成肺臟持續(xù)損害的關(guān)鍵，其機(jī)制迄今尚未闡明［3］。近年，有學(xué)者［4-5］通過分析耐PQ的突變植株，發(fā)現(xiàn)了PQ在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蓄積的重要機(jī)制，這為我們研究PQ在哺乳動物細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制提供了新思路。本研究通過濃度遞增持續(xù)誘導(dǎo)篩選獲得耐PQ的人肺腺癌細(xì)胞株（A549/ PQ），旨在為PQ中毒毒理及其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究、探索逆轉(zhuǎn)PQ毒性途徑提供細(xì)胞模型。

1　材料和方法

1.1材料 人肺腺癌細(xì)胞（A549）由上海東方肝膽外科醫(yī)院病毒與基因治療實(shí)驗(yàn)室保存，PQ購自美國Sigma公司，胎牛血清、1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，LDH試劑盒、細(xì)胞周期與凋亡試劑盒均由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供。細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo），Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海艾力特公司），ELx800酶標(biāo)儀（美國BioTek），倒置顯微鏡（Leica公司），照相機(jī)（日本Nikon），流式細(xì)胞儀（美國BD）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和A549/PQ建立 A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，條件為37 ℃，5% CO2。每次取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

采用逐步提高培養(yǎng)基中PQ濃度的方法來誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥，PQ在培養(yǎng)基中的濃度首先從100 μmol/L開始，加藥24 h后換液去除藥物，待細(xì)胞重新生長至對數(shù)期后再次加相同濃度PQ刺激，如此重復(fù)3次后，延長暴露時(shí)間至48 h，重復(fù)上述過程，再增加PQ濃度。所用PQ濃度依次為100、200、400、600、800 μmol/L，連續(xù)培養(yǎng)11個(gè)月，得到A549耐PQ細(xì)胞株，命名為A549/PQ。

1.3細(xì)胞形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的A549和A549/ PQ細(xì)胞，常規(guī)消化傳代后，使用Leica光學(xué)顯微鏡在24 h細(xì)胞完全貼壁后觀察細(xì)胞形態(tài)，并用Nikon照相機(jī)拍照。

1.4細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線和測定倍增時(shí)間 取5×104個(gè)處于對數(shù)生長期、狀況良好的親本A549細(xì)胞和A549/PQ細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，分別接種到培養(yǎng)瓶中，每種細(xì)胞接種21瓶。24 h后開始細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，每天計(jì)數(shù)3瓶細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線。再根據(jù)公式計(jì)算倍增時(shí)間（DT），DT=t×lg2/（lgNt-lgN0），t為細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，N0為接種24 h后測得的細(xì)胞數(shù)量平均值，Nt為培養(yǎng)t小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)量平均值。

1.5乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測法檢測細(xì)胞對PQ的敏感性 將對數(shù)生長期、生長狀況良好的A549細(xì)胞和A549/PQ細(xì)胞，接種到96孔板中，使待檢測時(shí)細(xì)胞密度不超過80%～90%滿。將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無細(xì)胞的培養(yǎng)液孔（背景空白對照孔），未經(jīng)藥物處理的對照細(xì)胞孔（樣品對照孔），未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔（樣品最大酶活性對照孔），以及PQ 400 μmol/L處理的細(xì)胞孔，800 μmol/L處理的細(xì)胞孔，每組3個(gè)復(fù)孔。處理48 h上酶標(biāo)儀490 nm處各測一次OD值。測得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對照孔吸光度后根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞死亡率，細(xì)胞死亡率（%）=（處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度）/（細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對照孔吸光度）×100。

1.6CCK-8法檢測計(jì)算耐藥指數(shù)（RI） 分別取對數(shù)生長期、生長狀況良好的親本A549細(xì)胞和A549/PQ細(xì)胞，接種到96孔板中，5×103/孔，每種細(xì)胞分成空白對照孔（無細(xì)胞有培養(yǎng)基），未經(jīng)藥物處理孔，PQ 400 μmol/L處理的細(xì)胞孔，800 μmol/L處理的細(xì)胞孔，1 200 μmol/L處理的細(xì)胞孔，每組3個(gè)復(fù)孔，處理48 h后上酶標(biāo)儀450 nm處各測OD值。公式計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率（%）=100-［A（加藥）-A（空白）］/［A（未加藥）-A（空白）］×100。利用GraphPad Prism 5軟件求半數(shù)抑制濃度（IC50）。RI等于A549/PQ細(xì)胞的IC50/親本A549細(xì)胞的IC50。

1.7PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 分別取對數(shù)生長期、狀況良好的親本A549細(xì)胞和A549/PQ細(xì)胞，胰酶消化，1 000 r/min離心5 min去上清，1 mL PBS重懸，再次1 000 r/min離心5 min去上清，加入1 mL預(yù)冷無水乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定12 h。將固定好的細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min去上清，每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃避光溫浴30 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 5.0軟件制圖。

2　結(jié)果

2.1光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 普通光鏡見A549/PQ體積較親本A549體積增大，且A549/PQ細(xì)胞形態(tài)呈多態(tài)化，不規(guī)則，細(xì)胞邊界模糊，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，有抱團(tuán)生長現(xiàn)象（見圖1B），而親本A549形態(tài)規(guī)則，排列整齊（見圖1A）。

2.2細(xì)胞生長曲線和倍增時(shí)間 A549/PQ和親本A549細(xì)胞的生長曲線見如圖2。親本A549細(xì)胞的倍增時(shí)間是（36.6±7.64）h，A549/PQ細(xì)胞的倍增時(shí)間（59.67±20.48）h，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見圖3。

2.3細(xì)胞對PQ的敏感性 親本A549和耐藥A549/PQ在不同PQ濃度誘導(dǎo)下死亡率見圖4。PQ濃度為400 μmol/L，親本A549死亡率為（26.15±1.19）%，耐藥A549/PQ死亡率為（17.39±2.18）%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PQ濃度為800 μmol/L時(shí)，A549死亡率為（43.59±4.78）%，A549/PQ死亡率為（26.65±2.91）%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　光鏡下A549和A549/PQ細(xì)胞形態(tài)（×200）

圖2　A549/PQ和親本A549細(xì)胞生長曲線

圖3　A549和A549/PQ細(xì)胞倍增時(shí)間比較

圖4　PQ誘導(dǎo)A549和A549/PQ細(xì)胞死亡率的比較

2.4細(xì)胞存活率及RI 不同濃度PQ暴露后A549與A549/PQ細(xì)胞存活率曲線見圖5。利用GraphPad Prism 5.0軟件求得A549對PQ的IC50為（215.03±63.62）μmol/L，A549/PQ對PQ的IC50為（1716.33±184.78）μmol/L，如圖6所示，2組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A549/PQ的RI為7.98，A549/PQ對PQ中度耐受。

圖5　PQ暴露后A549和A549/PQ細(xì)胞生存率曲線

圖6　PQ誘導(dǎo)A549和A549/PQ細(xì)胞IC50的比較

2.5細(xì)胞周期分布 細(xì)胞周期分布見表1。與A549比較，A549/PQ細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少（P＜0.05）。

表1　A549/PQ與A549細(xì)胞周期分布的比較（%，n=3，±s）

3　討論

體外建立耐藥細(xì)胞株是研究腫瘤耐藥特性及機(jī)制的重要手段。目前，已有多種誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞系的方法，主要包括濃度遞增連續(xù)誘導(dǎo)法和高劑量間斷暴露法兩大類［6］。一般認(rèn)為，濃度遞增連續(xù)誘導(dǎo)的方法是通過藥物持續(xù)作用，使腫瘤細(xì)胞生理和遺傳特性發(fā)生改變以逐漸適應(yīng)藥物的毒性，屬于獲得性耐藥，這種方法誘導(dǎo)成功率高［7］。本研究中，我們在濃度遞增連續(xù)暴露方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，即充分考慮濃度逐漸遞增的同時(shí)，又在同一濃度下采用逐漸延長暴露時(shí)間的方法，為A549細(xì)胞激活相關(guān)代償途徑提供緩沖時(shí)間，有利于細(xì)胞逐漸地適應(yīng)PQ的毒性，從而獲得對PQ的耐藥性，提高誘導(dǎo)成功率。迄今未見應(yīng)用這種辦法誘導(dǎo)建立對PQ耐藥人體細(xì)胞系的報(bào)道。

光鏡下觀察顯示耐藥A549/PQ細(xì)胞體積增大，邊界模糊，細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，表明耐藥細(xì)胞的代謝、分裂活動減弱。有研究［8-10］報(bào)道，耐藥細(xì)胞的生長減慢，也有研究［11］認(rèn)為耐藥細(xì)胞生長與親本細(xì)胞相近。本研究發(fā)現(xiàn)對PQ耐藥的A549細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延長。流式細(xì)胞術(shù)分析其細(xì)胞周期，表明A549/PQ細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞明顯多于親本A549細(xì)胞，S期細(xì)胞明顯少于親本細(xì)胞，說明耐藥株細(xì)胞DNA復(fù)制延長，增殖能力明顯減弱，細(xì)胞生長緩慢。可見A549/PQ細(xì)胞在形態(tài)學(xué)及生長方面均與親本細(xì)胞存在明顯差異。我們進(jìn)一步分析了A549/PQ細(xì)胞對PQ的抗性作用。CCK-8是檢測細(xì)胞增殖能力的敏感方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與親本細(xì)胞比，PQ暴露后耐藥A549/PQ細(xì)胞存活率明顯高于親本細(xì)胞，其RI為7.98，據(jù)Snow等［12］的標(biāo)準(zhǔn)，為中度耐藥。LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，同一濃度PQ誘導(dǎo)的A549/PQ細(xì)胞死亡率明顯低于親本細(xì)胞，顯示了耐藥A549/PQ細(xì)胞對PQ毒性具有良好的耐受性。

近年，全國PQ急性中毒患者呈倍數(shù)增長［13-14］，臨床上缺乏有效的救治措施，病死率高達(dá)50%以上，已成為急性中毒救治的突出難題［3］。肺臟是PQ中毒損傷的主要靶器官，中毒患者多死于急性肺損傷及肺纖維化，其機(jī)制復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、炎癥損傷、細(xì)胞凋亡等，尚未闡明［15-18］。A549細(xì)胞株是來源于人肺腺上皮的腫瘤細(xì)胞，本研究選擇該細(xì)胞株進(jìn)行耐藥株培養(yǎng)，具有一定的代表意義。A549/PQ細(xì)胞長期經(jīng)PQ的暴露，逐漸形成對PQ毒性的拮抗能力。發(fā)掘其拮抗PQ毒性的機(jī)制，將為PQ的毒理機(jī)制及干預(yù)研究提供大量有價(jià)值的信息。此外，由于PQ是一種強(qiáng)氧化劑，A549/PQ細(xì)胞株同時(shí)也為氧化應(yīng)激損傷機(jī)制研究提供良好的細(xì)胞模型。

［1］Gawarammana IB， Buckley NA. Medical management of paraquat ingestion［J］. Br J Clin Pharmacol， 2011， 72（5）: 745-757.

［2］Dinis-Oliveira RJ， Duarte JA， Sánchez-Navarro A， et al. Paraquat poisonings: mechanisms of lung toxicity， clinical features， and treatment［J］. Crit Rev Toxicol， 2008， 38（1）: 13-71.

［3］中國醫(yī)師協(xié)會急診醫(yī)師分會. 急性百草枯中毒診治專家共識（2013）［J］. 中國急救醫(yī)學(xué)， 2013， 3 3（6）: 484-489.

［4］An J， Shen X， Ma Q， et al. Transcriptome profiling to discover putative genes associated with paraquat resistance in goosegrass （Eleusine indica L.）［J］. PLoS One， 2014， 9（6）: e99940.

［5］Fujita M， Fujita Y， Iuchi S， et al. Natural variation in a polyamine transporter determines paraquat tolerance in Arabidopsis［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2012， 109（16）: 6343-6347.

［6］蔣東海. 新型乳腺癌耐藥細(xì)胞的建立、鑒定及耐藥逆轉(zhuǎn)［D］. 杭州: 浙江大學(xué)， 2011: 9-11.

［7］Negoro K， Yamano Y， Fushimi K， et al. Establishment and characterization of a cisplatin-resistant cell line， KB-R， derived from oral carcinoma cell line， KB［J］. Int J Oncol，2007， 30（6）: 1325-1332.

［8］王建軍， 趙暉， 林峰， 等. 耐甲氨蝶呤人骨肉瘤細(xì)胞株建立及其生物學(xué)特性［J］. 腫瘤， 2007， 27（8）: 623-627.

［9］董梅， 林晨， 馮奉儀， 等. 人肺腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞系的建立及其特性［J］. 癌癥， 2004， 23（6）: 6 67-671.

［10］張會軍， 閻蘊(yùn)力， 鄭力芬， 等. 人小細(xì)胞肺癌多藥耐藥細(xì)胞系H446/VP的建立及其生物學(xué)性狀［J］. 腫瘤， 2004， 24 （3）: 233-236.

［11］陳公琰， 楊朝陽， 洪璇， 等. 人肺腺癌耐藥細(xì)胞模型的建立及生物學(xué)特性的初步鑒定［J］. 中華醫(yī)學(xué)雜志， 2007， 87（13）: 924-926.

［12］Snow K， Judd W. Characterisation of adriamycin- and amsacrine-resistant human leukaemic T cell lines［J］. Br J Cancer，1991， 63（1）: 17-28.

［13］張寶蘭， 姚朗， 歐藝. 1991-2008年我國百草枯中毒文獻(xiàn)分析［J］. 中國急救醫(yī)學(xué)， 2010， 30（2）: 139-141.

［14］盧中秋， 洪廣亮， 趙光舉， 等. 百草枯急性中毒救治中的幾個(gè)焦點(diǎn)問題［J］. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志， 2013， 31（5）: 395-397.

［15］彭曉東， 陳驥， 梁創(chuàng). 急性百草枯中毒后MODS患者血清TNF-α和IL-10的變化及意義［J］. 中國實(shí)用醫(yī)藥， 2008， 3 （14）: 9-11.

［16］盧中秋， 賀曉艷， 洪廣亮， 等. 二巰丙磺鈉對急性百草枯中毒大鼠肺損傷的保護(hù)作用［J］. 中華內(nèi)科雜志， 2009， 48 （3）: 233-234.

［17］Hong GL， Liu JM， Zhao GJ， et al. The reversal of paraquatinduced mitochondria-mediated apoptosis by cycloartenyl ferulate， the important role of Nrf2 pathway［J］. Exp Cell Res， 2013， 319（18）: 2845-2855.

［18］Cai Q， Lu Z， Hong G， et al. Recombinant adenovirus Ad-RUNrf2 reduces paraquat-induced A549 injury［J］. Hum Exp Toxicol， 2012， 31（11）: 1102-1112.

（本文編輯：吳健敏）

Establishment and characterization of a Paraquat-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549/PQ

HONG Guangliang， TAN Jiaping， DING Yingwei， ZHAO Guangju， LI Mengfang， LU Zhongqiu. Department of Emergency Medicine， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015

Objective: To establish Paraquat （PQ）-resistant A549 cell line （A549/PQ） and explore its biological characteristics. Methods: The A549 cells were periodically co-cultured with PQ at gradually increasing concentrations， and its biological characteristics were observed. The morphological features were checked with light microscope. Sensitivity to PQ was detected by LDH assay. The cell growth curve and doubling time were studied by cell counting. CCK-8 assay was used to measure the median inhibitory concentration （IC50） and resistance index （RI） of A549/PQ cells and flow cytometry was applied to evaluate the cells cycle distribution. Results: Compared with A549 cells， the changes for larger size， irregular shape and much wide cell gap were found in A549/PQ cells. LDH release induced by PQ in A549/PQ cells was significantly lower than that of A549 cells （P＜0.05）. CCK-8 assay showed higher IC50in A549/PQ cells than that in A549 cells （1716.33 & 215.03 μmol/L，P＜0.05） and RI was 7.98 in A549/PQ cells. Longer doubling time， increased G0/G1 phase cells and decreased cells in S phase were found in A549 cells （P＜0.05）. Conclusion: We successfully constructed a PQ-resistant A549 cell line with significantly different biological characteristics and therefore a good cellular model for PQ toxicity research.

Paraquat； resistant cell line； biological characteristics

R459.7

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.001

2015-02-01

浙江省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新學(xué)科建設(shè)計(jì)劃（11-CX26）；浙江省十二五高校重點(diǎn)學(xué)科；浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃（2012-XK-A28）。

洪廣亮（1979-），男，浙江淳安人，主治醫(yī)師，博士。

盧中秋，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，Email：lzq 640815@163.com。