衷鴻賓　韓麗偉　白玉龍　趙彥濤　李忠海

.組織工程 Tissue engineering.

骨粉和脫鈣液比例與脫鈣時間對脫鈣骨基質(zhì)誘導(dǎo)成骨影響的研究

衷鴻賓韓麗偉白玉龍趙彥濤李忠海

目的 探索骨粉和脫鈣液比例和脫鈣時間對脫鈣骨基質(zhì) （demineralized bone matrix，DBM）誘導(dǎo)成骨活性的影響。方法 以深低溫冷凍的供體骨為原材料，剔除軟組織、脫脂、清洗、干燥、粉碎等過程制備骨粉；調(diào)整脫鈣時間以及骨粉和脫鈣液的比例，利用 0.5 mol / L 鹽酸動態(tài)脫鈣；清洗、冷凍干燥、輻照滅菌，得到 DBM 樣品。對樣品進(jìn)行 pH 值和鈣含量測定，從影像學(xué)觀察顯影效果，對其成骨活性進(jìn)行體內(nèi)骨誘導(dǎo)驗證。結(jié)果 測得 DBM-15-2 h、DBM-20-2 h、DBM-25-2 h、DBM-20-0.5 h、DBM-20-1 h、DBM-20-1.5 h 的鈣含量依次為 1.86±0.84、0.60±0.22、0.42±0.12、6.84±0.45、2.90±0.32、1.59±0.26；影像學(xué)結(jié)果顯示 DBM-20-0.5 h 材料的顯影密度相對最高；裸鼠體內(nèi)骨誘導(dǎo)組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，不同參數(shù)制備的 DBM 樣品均具有骨誘導(dǎo)活性，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。結(jié)論 骨粉和脫鈣液比例為 1 g / 20 ml，脫鈣 0.5 h，即可制得具有穩(wěn)定的骨誘導(dǎo)活性與一定顯影能力的 DBM。

骨基質(zhì)；礦物質(zhì)；骨再生；移植，同種；脫鈣骨

1668 年，VanMeekren［1］開展了最早的骨移植，自體骨移植因其骨量有限，且需二次手術(shù)，隨之帶來的并發(fā)癥也限制了其臨床應(yīng)用［2］；異體骨移植資源相對豐富，在美國等發(fā)達(dá)國家應(yīng)用最為廣泛［3-4］。Urist 等［5］1965 年首次提出脫鈣骨基質(zhì) （demineralized bone matrix，DBM）有誘導(dǎo)成骨的能力，開創(chuàng)了骨誘導(dǎo)研究的新領(lǐng)域。DBM 的發(fā)展在國內(nèi)也備受關(guān)注，很多學(xué)者針對 DBM 的制備工藝進(jìn)行了研究，期望得到既有骨誘導(dǎo)能力又適合工藝生產(chǎn)的技術(shù)［6-8］。

脫鈣工藝是制備 DBM 的關(guān)鍵步驟［9］，使用鹽酸脫鈣處理，除去部分或絕大多數(shù)鈣鹽，為營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的進(jìn)出提供通道，并保留骨生長所需的生物活性成分。本研究擬對供體皮質(zhì)骨進(jìn)行動態(tài)脫鈣處理，通過調(diào)整脫鈣時間以及骨粉和脫鈣液的比例，制備出具有一定顯影能力、鈣含量穩(wěn)定的DBM，加速 DBM 的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，降低生產(chǎn)成本，保護(hù)環(huán)境。

材料與方法

一、使用材料

鹽酸 （分析純，20150303，北京化學(xué)試劑廠）；過氧化氫 （30%，20140918，北京化工廠）；戊巴比妥鈉 （Sigma 公司，美國）、氯化鈉注射液 （0.9%，20131226，山東康寧藥業(yè)有限公司）、10% 中性甲醛 （20140110，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）、純化水。

超聲波清洗器 （KQ250B 型，昆山市超聲波儀器有限公司，中國）；pH 計 （Ohaus，starter 3100，美國）；電子秤 （LT 型，上海精密儀器儀表有限公司，中國）；連續(xù)光譜測讀儀 （Spectra max PLUS 384，Spectra 公司，美國）；分析天平 （XS 105 雙量程，梅特勒-托利多儀器有限公司，中國）；恒溫振蕩器 （THZ-82 型，常州國華儀器設(shè)備總廠，中國）；壓力滅菌器 （立式，SANYO 公司，日本）；超凈工作臺 （ZHJH-1214 型，上海智城分析儀器制造有限公司，中國）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （Binder FD 115，BINDER 公司，德國）；標(biāo)準(zhǔn)分樣篩 （上海分樣篩廠，中國）；組織學(xué)包埋機(jī) （Leica EG 1150 H，Leica 公司，德國）；組織學(xué)切片機(jī) （Leica RM 2165，Leica 公司，德國）；光學(xué)顯微鏡、圖像分析軟件（DS-FilC-U3，Nikon 公司，日本）。

裸小鼠 （20±2.0）g，中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供；骨科常用手術(shù)器械；X 線攝片機(jī)等。

二、實驗方法

1. 樣品制備：將深低溫冷凍供體骨切割后，用高壓水流沖洗去除新鮮骨中的骨髓，過氧化氫脫脂，清洗后冷凍干燥，粉碎制備粒徑為 282～710 μm骨粉，將不等量的骨粉各放置于不同的容器內(nèi)；0.5 mol / L 鹽酸動態(tài)脫鈣，中間均換液 1 次，至預(yù)定時間取出；純化水沖洗至洗液 pH 為中性；冷凍干燥后，25 KGy 輻照滅菌。得到 DBM 樣品。實驗共分為 6 組，固定脫鈣時間為 2 h，改變骨粉和0.5 mol / L 鹽酸脫鈣液的比例，分別為 1 g / 15 ml、 1 g / 20 ml、1 g / 25 ml，得到 DBM 樣品 （依次標(biāo)記為 DBM-15-2 h、DBM-20-2 h、DBM-25-2 h）。固定骨粉和脫鈣液的比例為 1 g / 20 ml，動態(tài)脫鈣時間分別為 0.5、1、1.5 h，得到 DBM 樣品 （依次標(biāo)記為 DBM-20-0.5 h、DBM-20-1 h、DBM-20-1.5 h）（表1）。

2. pH 測定：取 1 ml 固體樣品，用新煮沸的蒸餾水 20 ml 稀釋，超聲震蕩 10 min 后，靜置 10 min，測其 pH。重復(fù) 3 次，取平均值。

3. 鈣含量測定：分別精確稱取各樣品 0.5 g，加混合酸過夜，電爐消化至干透，MilliQ 超純水溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至 25 ml 容量瓶定容，取 5 ml 溶液用超純水稀釋定容至 25 ml 成為測試液?；鹧嬖游辗y定骨顆粒中鈣含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

4. X 線觀察：將實驗樣品材料在 X 線下觀察（曝光條件為：45 kV，100 mA，0.12 s），從影像學(xué)評價顯影效果。

5. 體內(nèi)骨誘導(dǎo)試驗：以裸小鼠為試驗?zāi)Ｐ?，在其腿部肌間隙進(jìn)行骨誘導(dǎo)實驗，植入材料分別為 DBM-15-2 h、DBM-20-2 h、DBM-25-2 h、DBM-20-0.5 h、DBM-20-1 h、DBM-20-1.5 h，共6 組，每組 6 只，共 36 只。0.3% 戊巴比妥腹腔麻醉，分別植入等量的樣品。術(shù)后 4 周，用 CO2處死裸小鼠后取材，10% 甲醛溶液固定，經(jīng)過脫鈣、脫水、包埋、切片等過程，制成標(biāo)本切片，HE、甲苯胺藍(lán)染色，對其組織學(xué)形態(tài)進(jìn)行觀察。按照 OI（osteoinduction）標(biāo)準(zhǔn)［10］進(jìn)行活性分級 （表2）。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

表1 實驗分組Tab.1 Experiment grouping design

表2 骨誘導(dǎo)評分標(biāo)準(zhǔn) OITab.2 Osteoinduction （OI）scoring of histologic sections

結(jié)　果

一、pH 值和鈣含量

測定各個樣品的 pH 值和鈣離子的含量，結(jié)果（表3）顯示，隨著脫鈣液比例的增加，樣品的鈣含量從 1.86% 降至 0.42%；當(dāng)骨粉 / 脫鈣液為 1 g / 20 ml 時，隨著脫鈣時間的延長，樣品的鈣含量明顯降低，依次為 6.84%、2.90%、1.59%、0.42%。各個樣品的 pH 穩(wěn)定在 5.92～6.20；相對于骨粉來說，各個樣品的鈣含量變化顯著。

表3 各個樣品的 pH 值和鈣含量Tab.3 The pH and calcium content of samples

表4 材料骨誘導(dǎo)活性評分 （OI）Tab.4 The scores of bone induction activity by OI

二、X 線觀察

X 線觀察結(jié)果顯示 6 個 DBM 樣品呈現(xiàn)不同的顯影能力。隨著脫鈣液量的增加，顯影密度逐漸降低。當(dāng)骨粉 / 脫鈣液為 1 g / 20 ml 時，隨著脫鈣時間的延長，顯影密度明顯下降。其中 DBM-20-2 h、DBM-25-2 h 材料幾乎不顯影，DBM-20-0.5 h 材料有最高密度影像，該結(jié)果與鈣含量檢測結(jié)果相呼應(yīng) （圖1）。

三、體內(nèi)骨誘導(dǎo)試驗

選用裸鼠模型，進(jìn)行異位骨誘導(dǎo)實驗。術(shù)后觀察動物傷口處，無腫脹、滲出等不良反應(yīng)，無明顯炎癥反應(yīng)，傷口愈合較好。組織學(xué)觀察 4 周 （圖2），各組均有明顯的成骨現(xiàn)象，有新骨、軟骨以及類骨髓腔結(jié)構(gòu)形成，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＞ 0.5）。在每個組織塊上隨機(jī)選取 3 個層面制備切片，利用Photoshop 和 Image J 軟件計算新骨的生成量，取平均值。OI 標(biāo)準(zhǔn)評分及新骨面積結(jié)果見表4。

圖1 材料 X 線片圖Fig.1 The X-ray of samples

圖2 裸鼠術(shù)后 4 周組織學(xué)觀察 （HE ×200）a：DBM-15-2 h；b：DBM-20-2 h；c：DBM-25-2 h；d：DBM-20-0.5 h；e：DBM-20-1 h；f：DBM-20-1.5 hFig.2 Histological findings from the mice after 4 weeks （HE ×200）　a： DBM-15-2 h； b： DBM-20-2 h； c： DBM-25-2 h； d： DBM-20-0.5 h；e： DBM-20-1 h； f： DBM-20-1.5 h

討　論

骨組織中的無機(jī)成分為磷酸鹽［11］，本實驗通過火焰原子吸收法測定骨顆粒中鈣含量為 （24.60± 2.00）wt %，根據(jù)化學(xué)計量比及離子守恒定律，一個鈣離子需要兩個氫離子來解離。理論計算得出，1 g 骨粉完全脫鈣需要 0.5 mol / L 脫鈣液 （24.60± 2.00）ml。實際脫鈣過程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，脫鈣液中氫離子濃度下降，導(dǎo)致脫鈣反應(yīng)速率逐漸下降，為了節(jié)約時間成本，在保證脫鈣液總量一定的情況下，采用少量多次的換液操作來縮短脫鈣時間。為保證脫鈣效果，脫鈣過程中脫鈣液均過量使用。本實驗 DBM-15-2 h 組脫鈣液用量最少，為30 ml / g （骨粉 / 脫鈣液比例為：1 g / 15 ml，中間換液 1 次，脫鈣液共計為 30 ml）。各樣品 pH 值和鈣含量的測定結(jié)果顯示，各條件下制備的 DBM 均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) （Ca%＜8%）［12］。

通過脫鈣處理后，DBM 因鈣離子的丟失，其X 線的顯影效果顯著下降，為了便于術(shù)中和術(shù)后觀察，DBM 應(yīng)具備一定的顯影能力；此外，DBM 中殘留的鈣離子有助于成骨細(xì)胞的分化以及礦物質(zhì)的沉積，對骨修復(fù)具有促進(jìn)作用［13］。X 線下觀察 6 種制備的 DBM 發(fā)現(xiàn)，DBM-20-2 h、DBM-25-2 h 材料幾乎不顯影，其余具有不同程度的顯影，其中 DBM-20-0.5 h 材料鈣含量相對較高為 6.84%，顯影效果最好。

骨誘導(dǎo)活性一直是 DBM 制備和使用過程中最關(guān)注的問題。DBM 含有多種成骨因子，主要有骨形態(tài)發(fā)生蛋白 （bone morphogenetic protein，BMP）、β 轉(zhuǎn)化生長因子 （transforminggrowthfaetorp，TGF-β）、成纖維細(xì)胞生長因子 （fibroblast growth faetor，F(xiàn)GF）、胰島素樣生長因子 （insulin-like gowth factor，IGF）和血小板衍生生長因子 （platelet-derived growth factor，PDGF）等。Wildemann 等［14］采用三種不同方法檢測了骨中各個成骨因子的含量，有學(xué)者測得供體骨制備的 DBM 中人 BMP 總量為 （110.95±48.44）ng / g［15］。本研究選用裸鼠模型，進(jìn)行異位骨誘導(dǎo)體內(nèi)實驗。術(shù)后組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，各組均有明顯的成骨現(xiàn)象，有新骨、軟骨以及類骨髓腔結(jié)構(gòu)形成，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明動態(tài)脫鈣工藝［6］在一定范圍內(nèi)調(diào)整脫鈣液比例或者脫鈣時間，即獲得可在 X 線下顯影的 DBM 樣品，也不影響其骨誘導(dǎo)活性。

本實驗利用體內(nèi)試驗驗證了合理調(diào)節(jié)骨粉和脫鈣液的比例，控制脫鈣時間，既可制得具有一定顯影能力、鈣含量穩(wěn)定的 DBM，同時也能保證 DBM的骨誘導(dǎo)活性。工藝生產(chǎn)過程中，通過工藝調(diào)節(jié)降低生產(chǎn)成本，提高工作效率，減少環(huán)境污染，這是規(guī)?；a(chǎn)中人們需要關(guān)注的重要內(nèi)容。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)骨粉和脫鈣液比例為 1 g∶20 ml，動態(tài)脫鈣 0.5 h，即可制得具有優(yōu)良骨誘導(dǎo)活性，且具有一定顯影能力的 DBM。

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（本文編輯：李貴存）

Preparation of radiopaque demineralized bone matrix by dynamic decalcification process

ZHONG Hong-bin，HAN Li-wei， BAI Yu-long， ZHAO Yan-tao， LI Zhong-hai. Department of Orthopedics， the frst Affliated Hospital of PLA General Hospital， Beijing， 100048， PRC

ObjectiveTo prepare demineralized bone matrix （DBM）with a stable calcium content and could be displayed under X-ray by accurate control of the decalcification process. MethodsRaw materials were from the donor bone stored in cryopreservation. Hydrochloric acid was used as decalcifcation solution. Soft tissue removal， degreasing， cleaning， drying， grinding and other processes were applied in the preparation of bone powder. Decalcifcation time as well as decalcifcation solution ratio were adjusted， and 0.5 mol / L hydrochloric acid dynamic decalcifcation was performed. DBM sample was obtained after cleaning， freeze drying and irradiation sterilization. The pH value， calcium content and imaging under X-ray were measured. Osteoinductivity was evaluated by implantation test in nude mice. ResultsThe content of calcium of the DBM-15-2 h， DBM-20-2 h， DBM-25-2 h， DBM-20-0.5 h， DBM-20-1 h and DBM-20-1.5 h were 1.86±0.84， 0.60±0.22， 0.42±0.12， 6.84±0.45， 2.90±0.32 and 1.59±0.26，respectively. The brightness of the DBM-20-0.5 h sample was the highest under X-ray. The bone induction activity was seen in 4 weeks. There were no signifcant differences in osteoinductivity in 6 samples （P＞0.05）. Conclusions A stable， radiopaque and osteoinductive DBM can be obtained when bone powder and decalcifcation solution ratio is 1 g / 20 ml （decalcifed 0.5 h）.

Bone matrix；Minerals；Bone regeneration； Transplantation， homologous；Demineralized bone

10.3969/j.issn.2095-252X.2015.11.003

R318

國家自然科學(xué)基金項目 （81201380）；軍事醫(yī)學(xué)項目 （13CXZ028），（AWS14C007）；北京市自然科學(xué)基金（7152144）；北京市科技新星項目 （XXJH2015102）；304 醫(yī)院臨床部重點扶持項目 （2014ZD001）

100048北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院骨科、北京市骨科植入醫(yī)療器械工程技術(shù)研究中心

2015-07-08）