廖丹，劉睿，曾瀚慶

β-連環(huán)素對卵巢癌細胞順鉑耐藥性的影響

廖丹，劉睿，曾瀚慶

目的：探討信號分子β連環(huán)素（β-catenin）在多個卵巢癌耐藥細胞系中的表達及其對順鉑耐藥性的影響。方法：首先在2個卵巢癌耐藥細胞系（C13K，SKOV-3），2個卵巢癌敏感細胞系（OV2008，A2780），A2780順鉑敏感株、A2780-cis順鉑耐藥株，COC10順鉑敏感株、COC1-cis順鉑耐藥株中檢測β-catenin蛋白的水平。通過小干擾RNA （siRNA）介導的RNA干擾技術靶向沉默細胞中β-catenin的表達，實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）驗證β-catenin基因沉默效果。臺盼藍染色方法分析β-catenin基因沉默對細胞化療藥物順鉑敏感性的影響，流式細胞術檢測順鉑處理后β-catenin基因沉默細胞的凋亡率。Western blotting篩選多個凋亡相關信號分子的改變。結果：β-catenin在2個卵巢癌耐藥細胞系C13K，SKOV-3中蛋白水平較敏感細胞系明顯上調(diào)。與親本A2780和COC10細胞相比，在耐藥株A2780-cis和COC1-cis中表達水平也明顯增高。β-catenin siRNA能顯著抑制細胞中β-catenin蛋白的水平。β-catenin基因沉默后，卵巢癌耐藥細胞C13K，SKOV-3對順鉑敏感性顯著增高；流式細胞術進一步分析發(fā)現(xiàn)β-catenin基因沉默可以促進順鉑介導的卵巢癌耐藥細胞的細胞凋亡。Western blotting發(fā)現(xiàn)βcatenin基因沉默后，順鉑處理可以顯著上調(diào)促凋亡分子p53和caspase-3蛋白水平。結論：β-catenin在卵巢癌耐藥細胞系表達明顯增高，β-catenin沉默可以促進卵巢癌耐藥細胞對順鉑的敏感性，并同時促進了順鉑介導的細胞凋亡。

卵巢腫瘤；腫瘤細胞系；β連環(huán)素；順鉑；抗藥性，腫瘤

【Abstract】Objective:To investigate the expression of β-catenin in several human ovarian cancer cell lines and its effect on cisplatin resistance.Methods：The protein level of β-catenin in two cisplatin-resistant cell lines（C13K，SKOV-3），two cisplatin-sensitive cell lines（OV2008，A2780），A2780，A2780-cis，COC10 and COC1-cis was examined by real-time PCR and western blotting analysis.Expression of β-catenin in ovarian cancer cells was knockdown by siRNA transfection.The effect of β-catenin silencing on cisplatin resistance was examined by trypan blue staining and flowcytometry.The change of apoptosisrelated proteins were examined by western blotting analysis.Results：The expression of β-catenin was upregulated in cisplatinresistant cell lines（C13K，SKOV-3）compared with cisplatin-sensitive cell lines.The expression of β-catenin in cisplatinresistant A2780 and COC1 was also higher than that in paretnal A2780 and COC1 cells.siRNA targeting β-catenin effectively knockdown expression of β-catenin in ovarian cancer cells.Silencing of β-catenin enhanced the sensitivity of cisplatin-resistant cells（C13K，SKOV-3）to cisplatin.β-catenin siRNA also resulted in more apoptosis compared with control siRNA.Cisplatin treatment in β-catenin silencing cells induced the expression of apoptosis-related protein p53 and caspase-3.Conclusions：These finding suggested that β-catenin was upregulated in cisplatin-resistant cells.Gene silencing of β-catenin enhanced sensitivity to cisplatin in cisplatin-resistant cells by inducing more cisplatin-mediated apoptosis.

【Keywords】Ovarian neoplasms；Cell line，tumor；Beta catenin；Cisplatin；Drug resistance，neoplasm

（J Int Obstet Gynecol，2015，42：108-111）

卵巢癌的發(fā)病率在女性生殖器惡性腫瘤中居第3位，但病死率卻高居第1位。盡管近10年來開展了在腫瘤細胞減滅術基礎上聯(lián)合順鉑為主的治療方案，但卵巢癌患者的5年生存率一直在20％～30％左右，其主要原因是卵巢癌對化療藥物產(chǎn)生了耐藥性。耐藥性的產(chǎn)生直接影響了化療效果和患者生存率，因此研究卵巢癌細胞耐藥發(fā)生的機制對于防止或逆轉(zhuǎn)耐藥產(chǎn)生、改善化療效果、提高患者生存率有著很重要的意義。

卵巢癌耐藥的產(chǎn)生是多因素、多層次、多途徑共同作用的結果。目前研究發(fā)現(xiàn)多個信號分子或信號通路參與了卵巢癌耐藥發(fā)生的機制，例如白細胞介素6（IL-6）［1］、酪氨酸蛋白激酶（Src）家族［2］、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路［3］等。β連環(huán)素（β-catenin）是Wnt信號通路中的關鍵分子，作為信號分子主要參與細胞分化［4］、細胞凋亡［5］、細胞增殖［6］及多種腫瘤的遷移侵襲過程［7］等。已有研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin參與了多種腫瘤細胞的耐藥過程，如肝癌［8］、肺癌［9］和神經(jīng)母細胞瘤［10］等。本研究主要探討β-catenin與卵巢癌順鉑耐藥的關系，通過RNA干擾技術沉默β-catenin基因后，觀察其對耐藥卵巢癌細胞藥物敏感性的影響，為卵巢癌細胞耐藥發(fā)生的機制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料β-catenin抗體（Abcam，英國），p53抗體和caspase-3（cell signaling technology，美國），β-actin抗體（Sigma-Aldrich，美國），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的驢抗兔IgG抗體（GE healthcare公司，美國），臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒（碧云天），凋亡檢測試劑盒（Annexin V-PE Apoptosis Detection Kit，Abcam公司），小干擾RNA（siRNA）購自Invitrogen公司，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國）。

1.2細胞培養(yǎng)卵巢癌細胞系 C13K，A2780，OV2008，SKOV-3均培養(yǎng)于含有10％胎牛血清、1％青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在含5％CO2、37℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）分析使用RIPA裂解液裂解細胞，離心去除細胞碎片，提取各細胞總蛋白后二喹啉甲酸（BCA）法測蛋白濃度。取其等量（30 μg）細胞蛋白樣品變性后上樣經(jīng)8％聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，以90 V電轉(zhuǎn)膜4 h將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜。轉(zhuǎn)移好的NC膜5％脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育搖床過夜（βcatenin抗體1∶3 000稀釋），Tris-Hcl緩沖液溶液（TBST）洗膜3次，每次5 min，二抗室溫孵育2 h（二抗為HRP標記的驢抗兔免疫球蛋白G（IgG）1∶3 000稀釋），用TBST洗膜后，加入化學發(fā)光試劑（ECL）后顯影。以β-actin為內(nèi)參。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）分析提取細胞的總RNA，20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應體系為：RNA 1 μg、Master mix 4 μL、酶1 μL、去RNA酶（Rnase）水。混勻，按下列條件進行反應：25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃5 min。取1 μL互補DNA（cDNA），SYB Green 5 μL，引物（primer，10 μmol/ L）各0.2 μL，去Rnase水3.6 μL，混勻，按下列條件進行反應：94℃20 s，60℃20 s，72℃15 s，共35個循環(huán)。每個實驗樣本均采用3管重復，重復3次，取其平均值。

1.5臺盼藍染色方法將對照siRNA和β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染細胞24 h后，加入適量胰酶消化細胞，用培養(yǎng)基重懸細胞。同時以未轉(zhuǎn)染組為對照細胞。以每孔4×104細胞接種6孔板，24 h孵育后加入順鉑（60 μmol/L）處理48 h后在不同的時間點收集細胞。吸取100 μL重懸的細胞到塑料離心管內(nèi)，加入100 μL臺盼藍染色液，輕輕混勻，染色3 min；吸取少量經(jīng)過染色的細胞，用血細胞計數(shù)板計數(shù)。具體檢測方法參照試劑盒說明書。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡將對照siRNA和β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染細胞3 d后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌貼壁細胞1次，加入適量胰酶消化細胞，用培養(yǎng)基重懸細胞，1 000×g離心5 min，棄上清。使用PBS洗滌細胞，棄上清，并加入500 μL Annexin V-PE結合液輕輕重懸細胞，加入5 μL Annexin V-PE，輕輕混勻，室溫（20～25℃）避光孵育5 min，隨即進行流式細胞儀檢測。

1.7siRNA轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA和control siRNA通過轉(zhuǎn)染試劑（lipofectamine 2000）分別轉(zhuǎn)染卵巢癌耐藥細胞系C13K和SKOV-3，具體操作見轉(zhuǎn)染試劑說明書。轉(zhuǎn)染72 h后Western blotting檢測細胞β-catenin的表達。

1.8統(tǒng)計學分析采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1β-catenin在人卵巢癌耐藥細胞系和卵巢癌敏感細胞系中的表達水平Western blotting結果顯示，β-catenin在卵巢癌耐藥細胞系C13K、SKOV-3的表達水平顯著高于敏感細胞系OV2008、A2780，見圖1。Western blotting結果進一步證實在耐藥的細胞中β-catenin的蛋白水平顯著高于其親本非耐藥的細胞，見圖2。

圖1　Western blotting檢測4個卵巢癌細胞系中β-catenin的表達

圖2　Western blotting檢測順鉑耐藥株和親本敏感株中β-catenin蛋白水平

2.2靶向β-catenin的siRNA的干擾效率檢測RT-PCR結果顯示，同對照siRNA相比β-cateninsiRNA抑制了β-catenin的mRNA水平，抑制率達90％，見圖3。Western blotting結果證實同對照siRNA相比，β-catenin siRNA成功地沉默了2個卵巢癌細胞系中β-catenin的表達（＞80％），見圖4。

圖3　RT-PCR驗證靶向β-catenin的siRNA的基因沉默效率

圖4　Westernblotting驗證靶向β-catenin的siRNA的基因沉默效率

2.3β-catenin在卵巢癌耐藥細胞對化療藥物順鉑的抵抗性臺盼藍染色方法結果顯示，在C13K和SKOV-3細胞中，經(jīng)順鉑處理3 d后，β-catenin基因沉默已經(jīng)對細胞增殖活力產(chǎn)生影響，同時轉(zhuǎn)染對照siRNA的細胞和未處理組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；經(jīng)順鉑處理后，β-catenin基因沉默的細胞增殖活力在不同的時間點（即3，4，5 d）均顯著低于對照細胞和未處理組細胞（P＜0.01），見圖5。

2.4β-catenin對順鉑誘導細胞凋亡的影響流式細胞術結果顯示，在β-catenin基因沉默的細胞中，順鉑處理誘導更多細胞處于凋亡狀態(tài)。在C13K細胞中，對照組細胞凋亡率為（19.4±0.9）％，β-catenin基因沉默的細胞凋亡率為（34.2±2.1）％，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.59，P＜0.05）；在SKOV-3細胞中，對照組細胞凋亡率為（9.6±1.1）％，β-catenin基因沉默細胞的凋亡率為（19.8±1.8）％，差異有統(tǒng)計學意義（t= 15.38，P＜0.05），見圖6（見后插一）。

2.5β-catenin對順鉑誘導的凋亡相關信號分子表達的影響為了進一步分析順鉑誘導細胞凋亡的分子機制，本研究篩選了一系列與凋亡相關的信號分子，包括p53，p73，caspase-3，caspase-7，B淋巴細胞瘤2（Bcl-2），Bcl-2相關X蛋白（Bax）等。本研究發(fā)現(xiàn)，在β-catenin表達沉默的細胞中，順鉑顯著增加了p53和caspase-3蛋白的表達，見圖7。

圖5　不同時間點順鉑處理后卵巢癌細胞活性

圖7　Western blotting檢測順鉑誘導凋亡相關蛋白的表達

3　討論

卵巢癌早期診斷困難，70％患者初診時已處于晚期，在腫瘤細胞減滅術的基礎上開展順鉑為主的聯(lián)合方案目前已成為卵巢癌的常規(guī)治療方案，然而卵巢癌細胞對順鉑存在耐藥導致患者5年生存率仍偏低。目前導致卵巢癌細胞對順鉑產(chǎn)生耐藥的具體分子機制并不十分清楚，近年廣泛關注細胞信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的功能。有研究發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-XL在卵巢癌耐藥細胞中表達水平較敏感細胞明顯上調(diào)，并通過下調(diào)細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶caspase-3的表達而參與卵巢癌細胞的順鉑耐藥過程［11］。George等［2］報道Src激酶活性的抑制可以增加細胞對化療藥物順鉑或紫杉醇的敏感性，并可扭轉(zhuǎn)耐藥細胞對紫杉醇的抗藥性。Lee等［3］也證實PI3K/AKT信號通路參與卵巢癌細胞的耐藥過程。在卵巢癌耐順鉑細胞株OVCAR-3/CDDP的AKT磷酸化水平明顯高于其親代細胞株OVCAR-3，同時順鉑處理可抑制親代細胞株中AKT磷酸化水平，而在耐藥的卵巢癌細胞中卻無此作用。另外，PI3K活性抑制劑可以明顯提高順鉑對耐藥細胞株誘導的細胞凋亡。

人類β-catenin基因又名β-catenin1，定位于染色體3q21。一方面β-catenin與鈣依賴性跨膜糖蛋白E鈣黏蛋白（E-cadherin）的胞內(nèi)段結合介導細胞間黏附、遷移等功能，對上皮極性和完整性的維持起重要作用；另一方面β-catenin參與Wnt通路的信號傳導，在調(diào)控細胞生長和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin卵巢癌耐藥細胞系中蛋白水平較敏感細胞系明顯上調(diào)。β-catenin基因沉默后，卵巢癌耐藥細胞C13K、SKOV-3對順鉑敏感性顯著增高，并同時伴隨著凋亡細胞數(shù)的增加。以上結果提示抑制β-catenin的表達可能通過促進細胞凋亡實現(xiàn)，從而增加了耐藥卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。

p53是重要的腫瘤抑制基因，該基因的突變或缺失是導致許多腫瘤發(fā)生的原因，同時p53可參與細胞凋亡過程而介導耐藥，而順鉑誘導腫瘤細胞凋亡是發(fā)揮其抗腫瘤作用的重要機制。目前已有研究發(fā)現(xiàn)順鉑可以通過誘導p53/Bax途徑，啟動線粒體凋亡途徑而殺傷卵巢癌細胞［12］。筆者前期的機制研究發(fā)現(xiàn)，在β-catenin表達沉默的細胞中，順鉑處理可以促進細胞凋亡的相關分子p53和caspase-3的表達的增高，提示p53/caspase-3信號通路可能參與了卵巢癌細胞的耐藥機制。

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The Effect of β-catenin on Cisplatin Resistance in Human Ovarian Cancer Cells

LIAO Dan，LIU Rui，ZENG Han-qing.
Department of Obstetrics and Gynecology（LIAO Dan），Department of General Surgery（LIU Rui），Nada Hospital of Hainan State Farms，Danzhou 571700，Hainan Province，China；Department of Hematology，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing400016，China（ZENGHan-qing）

LIAO Dan，E-mail：liaodancq1981@163.com

2014-02-24）

［本文編輯秦娟］

571700海南省儋州市農(nóng)墾那大醫(yī)院婦產(chǎn)科（廖丹），普外科（劉睿）；重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科（曾瀚慶）

廖丹，E-mail：liaodancq1981@163.com