馮　波，尹　翌，2，易旭東，林元山，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.長沙水地沙生物科技有限公司，湖南長沙410125）

康氏木霉固體發(fā)酵木聚糖酶條件的研究

馮波1，尹翌1，2，易旭東1，林元山1，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.長沙水地沙生物科技有限公司，湖南長沙410125）

通過固體發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)單因素及正交試驗分析，得出康氏木霉發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶最優(yōu)條件組合為：麩皮與玉米芯質(zhì)量比為2∶8，硫酸銨2.5%，MnSO40.50%，料水比1∶1.5（g∶mL），培養(yǎng)基初始pH自然，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵時間6 d。在此條件下，康氏木霉固體發(fā)酵木聚糖酶活力達11.98 IU/g。該木聚糖酶水解產(chǎn)物富含2～5個木糖分子的低聚木糖。

康氏木霉；木聚糖酶；固體發(fā)酵；優(yōu)化

木聚糖（xylan）是自然界中含量非常豐富的一類多糖，僅次于纖維素。木聚糖結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，包含有多種不同的側(cè)鏈基團，需要在一系列具有不同功能和作用方式的水解酶類相互協(xié)同作用下才能將其徹底降解［1-2］。木聚糖酶（xylanase）是將木聚糖水解成低聚木糖和木寡糖的一類酶的總稱，包含有多種內(nèi)切酶和外切酶的一個復(fù)合酶系，主要分為內(nèi)切β-1，4-D-木聚糖酶，β-D-木糖苷酶，α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶，α-D-葡萄糖醛酸苷酶，乙酰木聚糖酯酶和酚酸酯酶等［3-4］。近年來，木聚糖酶已經(jīng)在很多行業(yè)展露出潛在的優(yōu)勢，可應(yīng)用于功能性低聚糖的生產(chǎn)、面團改良劑、飼料添加劑，在造紙、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)也有廣泛應(yīng)用［5-6］。功能性低聚糖是雙歧桿菌增殖因子［7］，能夠調(diào)節(jié)畜禽腸道益生菌群，減少抗生素的使用，實現(xiàn)環(huán)保養(yǎng)殖［8-9］。目前，功能性低聚木糖在飼料行業(yè)已成為熱點，市場前景良好，李敏康等［10］進行了木霉固態(tài)發(fā)酵麥麩制備低聚木糖的初步研究。本試驗旨在獲取康氏木霉內(nèi)切木聚糖酶，以制備功能性低聚木糖，并通過優(yōu)化產(chǎn)酶條件提高木聚糖酶活力。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試劑

V900513櫸木木聚糖：美國Sigma公司；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚、無水亞硫酸鈉、四水酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、正丁醇、冰醋酸、二苯胺、苯胺、木糖等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2菌種

康氏木霉（Trichoderma koningiiLys-368）：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院實驗室保存。

1.1.3培養(yǎng)基

麩皮斜面培養(yǎng)基：麩皮汁5.0%，葡萄糖1.0%，瓊脂2.0%，水100 mL，自然pH，121℃滅菌25 min。

固體發(fā)酵初始培養(yǎng)基：玉米芯粉（過10目篩）10.0 g，（NH4）2SO41.0%，蒸餾水20 mL，pH自然，攪勻于250 mL三角瓶中，121℃滅菌25 min。

1.2儀器與設(shè)備

MJX-250BⅢ霉菌培養(yǎng)箱：天津泰斯特儀器有限公司；V-5000紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；SX-500立式壓力蒸汽滅菌鍋：日本TOMY KOGYO公司；CAV812電子天平：日本OHAUS公司。

1.3方法

1.3.1木聚糖酶活力測定方法

酶活力單位定義為：在pH值5.0，溫度50℃條件下，每分鐘水解木聚糖底物溶液生成1 μmol木糖所需的酶量為一個酶活力單位（IU）。

木糖還原糖的測定：參照GHOSE T K［11］的方法，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定。

酶活力的計算：酶活力按每克固體曲所產(chǎn)生的酶量進行計算，其中木糖含量由木糖標準曲線（Y=1.327 7X-0.033 8，X為OD540nm，R2=0.998）計算所得，酶活力計算公式如下：

式中：Y為通過木糖標準曲線計算出的木糖含量，mg；N為酶液的總稀釋倍數(shù)；M為木糖相對分子質(zhì)量150.13；t為反應(yīng)時間30 min；V為反應(yīng)體系中加入的酶液體積0.1 mL；m為固體發(fā)酵原料的質(zhì)量10 g。

1.3.2康氏木霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的條件研究

單因素試驗：以固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用單一變量原則，以酶活力為評價指標，先后確定發(fā)酵時間，溫度，碳源配比，氮源種類，氮源濃度，培養(yǎng)基料水比，培養(yǎng)基起始pH值，金屬離子對康氏木霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響。每組試驗分別做3組平行，取平均值。

正交試驗：選擇單因素試驗影響較大的金屬離子添加量，氮源，發(fā)酵時間，料水比4個因素，進行3水平正交試驗，確定最優(yōu)發(fā)酵條件組合。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行分析。

1.3.3木聚糖酶解產(chǎn)物分析

將1.0%木聚糖于50℃水浴中酶解反應(yīng)12 h，酶解產(chǎn)物薄層色譜定性檢測，參照LIN Y S等［12］的方案適當修改進行，薄層色譜檢測條件如下：

展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶水（4∶1∶1，V/V）；標樣為1%木糖，上樣0.5 μL；酶解產(chǎn)物上樣1.5 μL；顯色劑：2.0 g苯胺溶于2 mL二苯胺以及10 mL 85%H3PO4中；顯色條件：當展開劑上行至距硅膠板頂端0.5 cm處時，取出硅膠板，熱風(fēng)風(fēng)干，噴霧顯色劑，再將硅膠板置于80℃條件下顯色10 min，拍照記錄。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵周期的測定

以固體發(fā)酵初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，接種后置于30℃霉菌培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，從第2天開始，每天取樣測定木聚糖酶活力，其木聚糖酶活力變化曲線見圖1。

圖1　發(fā)酵時間對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.1 Effect of fermentation time on xylanase production by Trichoderma koningii

從圖1可以看出，康氏木霉在前3 d生長較為緩慢，木聚糖酶活力較低，至第4天時酶活力達到高峰（6.89 IU/g），此后緩慢下降。第4天至第6天木聚糖酶活力無顯著差異（P＜0.05，下同），因此，選擇康氏木霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的周期為4～6 d。

2.2最適培養(yǎng)溫度的測定

以固體發(fā)酵初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，接種后分別置于28℃，30℃，32℃，35℃，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，木聚糖酶活力變化結(jié)果見圖2。

圖2　溫度對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.2 Effect of temperature on xylanase production by Trichoderma koningii

由圖2可知，在28℃和30℃條件下所產(chǎn)木聚糖酶活力無顯著差異，與其他溫度條件差距明顯，＞30℃后酶活力下降?？凳夏久构腆w發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最佳培養(yǎng)溫度為30℃，此條件下木聚糖酶活力達7.03 IU/g。

2.3碳源配比的確定

以初始培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，碳源條件選擇不同麩皮和玉米芯粉質(zhì)量比0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1，10∶0進行發(fā)酵試驗，木聚糖酶活力結(jié)果見圖3。

圖3　碳源配比對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of carbon sources ratio on xylanase production by Trichoderma koningii

由圖3可知，木聚糖酶活力隨麩皮含量的增加呈先上升后下降趨勢，麩皮與玉米芯的質(zhì)量比為4∶6時木聚糖酶活力達到最高（7.95 IU/g），隨著麩皮含量的增大，培養(yǎng)基易結(jié)塊，透氣性較差，酶活力逐漸下降。從酶解產(chǎn)物薄層色譜分析（圖4）來看，麩皮/玉米芯粉質(zhì)量比為2∶8時，雖然酶活力只有6.89 IU/g，但所含低聚木糖成分較多，木二糖至木五糖的斑點較深，說明低聚木糖濃度較高。因此選擇麩皮與玉米芯粉質(zhì)量比為2∶8作為最佳碳源配比。

圖4　木聚糖酶反應(yīng)樣品的薄層層析結(jié)果Fig.4 Results of thin layer chromatography of samples by xylanase reaction

2.4氮源條件的確定

2.4.1不同氮源對康氏木霉固體發(fā)酵木聚糖酶的影響

圖5　不同氮源對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on xylanase productionbyTrichoderma koningii

在碳源為麩皮/玉米芯粉比例為2∶8（g∶g）的條件下，分別添加1.0%的硫酸銨、尿素、氯化銨、蛋白胨、酵母膏、黃豆粕、菜籽粕，考察氮源對木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，康氏木霉以硫酸銨為氮源進行固體發(fā)酵時，木聚糖酶活力達到7.68 IU/g，明顯高于其他氮源和對照。

2.4.2最適氮源添加量的優(yōu)化

以麩皮和玉米芯（2∶8）為培養(yǎng)基碳源，考察質(zhì)量分數(shù)為0、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%、4.00%、5.00%的硫酸銨對木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，當硫酸銨添加量達到2.50%時，木聚糖酶活力為9.04 IU/g，之后隨著硫酸銨添加量增加，木聚糖酶活力明顯下降。因此，選擇添加量硫酸銨添加量1.50%～2.50%進行正交試驗。

圖6　不同硫酸銨添加量對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.6 Effect of different（NH4）2SO4addition on xylanase production byTrichoderma koningii

2.5培養(yǎng)基料水比的優(yōu)化

圖7　料水比對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.7 Effect of material to water ratio on xylanase production byTrichoderma koningii

以麩皮和玉米芯（2∶8）為碳源，2.5%硫酸銨為氮源，將培養(yǎng)基固料與水配制成1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0，1∶2.5，1∶3.0，1∶3.5，1∶4.0（g∶mL）不同質(zhì)量比進行固體發(fā)酵，結(jié)果見圖7。從圖7可知，料水比為1∶1.0（g∶mL）時，木聚糖酶活力降低，原因可能為含水量過低，無法滿足霉菌生長所需的濕度，造成生物量較低，從而影響其產(chǎn)酶量；料水比為1∶1.5，1∶2.0，1∶2.5（g∶mL）這三個比例條件下酶活力較高，結(jié)果較為接近，料水比為1∶1.5（g∶mL）時酶活力最高（8.62 IU/g）；隨著含水量的繼續(xù)增加，酶活力下降明顯。因此選擇固料與水質(zhì)量比1∶1.5（g∶mL）為康氏木霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最適料水比，由于在料水比1∶1.0（g∶mL）條件下酶活力較低，因此正交試驗選擇料水比為1∶1.5～1∶2.5（g∶mL）進行正交試驗。

2.6培養(yǎng)基初始pH值的確定

將培養(yǎng)基起始pH值分別調(diào)至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，接種康氏木霉發(fā)酵木聚糖酶，結(jié)果見圖8。從圖8可知，培養(yǎng)基起始pH值對康氏木霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響并不顯著，木聚糖酶活力處于7.5～8.5 IU/g，發(fā)酵曲最終pH值維持在5.0～5.5，說明菌株康氏木霉具有一定的調(diào)節(jié)pH的能力。由于培養(yǎng)基自然pH值為5.5～6.2，因此，康氏木霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最適初始pH值無需調(diào)整，選擇自然狀態(tài)。

圖8　培養(yǎng)基初始pH值對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.8 Effect of initial pH on xylanase production by Trichoderma koningii

2.7金屬離子及添加量對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響

在上述試驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)之上，以不添加任何金屬離子為空白對照（CK），其他試驗組分別添加0.30%的MnSO4、CuSO4、MgSO4、KH2PO4、Fe2（SO4）3、CaCl2，考察不同金屬離子對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖9。從圖9可知，Mn2+具有明顯的促進作用，Mg2+，K+，Ca+的促進作用并不明顯，而Cu2+則具有明顯的抑制作用。

圖9　金屬離子對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.9 Effect of metal ions on xylanase production by Trichoderma koningii

根據(jù)上述試驗結(jié)果，以麩皮和玉米芯（2∶8）為培養(yǎng)基干料，添加2.5%硫酸銨，料水比為1∶1.5（g∶mL），再分別添加0，0.10%，0.30%，0.50%，0.70%，0.90%的MnSO4，考察Mn2+添加量對康氏木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖10。從圖10結(jié)果可知，隨著Mn2+添加量的增加，木聚糖酶活力也逐漸升高，添加量為0.50%時酶活力達到最大（11.72 IU/g），繼續(xù)添加后，酶活力迅速下降。因此，添加0.50%的Mn2+對康氏木霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的促進作用最強。

圖10　錳離子添加量對康氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.10 Effect of different Mn2+concentration on xylanase production byTrichoderma koningii

2.8正交試驗分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對康氏木霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶影響較為顯著的4個因素：Mn2+添加量，硫酸銨添加量，發(fā)酵時間，料水比為評價因素，以木聚糖酶活力為評價指標進行L9（34）的正交試驗，結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1　發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

從表1可知，通過R值的大?。≧D＞RB＞RA＞RC）分析，康氏木霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響因素由強到弱依次為Mn2+添加量，硫酸銨添加量，發(fā)酵時間，料水比；從k值分析可以得出最佳發(fā)酵條件組合為A3B3C1D3，即發(fā)酵時間為6 d，硫酸銨添加量為2.5%，料水比為1∶1.5（g∶mL），Mn2+添加量為0.50%。因此，得到最佳固體發(fā)酵條件為：麩皮與玉米芯質(zhì)量比為2∶8，硫酸銨2.5%，MnSO40.50%，料水比1∶1.5（g∶mL），pH自然，培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵時間6 d。在此條件下，進行發(fā)酵重復(fù)驗證試驗，木聚糖酶活力可達11.98 IU/g。

表2　正交試驗結(jié)果方差分析Table 2 Analysis of variance for orthogonal tests result

由表2可知，各因素對結(jié)果影響均不顯著。

3　結(jié)論

該試驗通過優(yōu)化康氏木霉實驗室固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的工藝，有效提高了木聚糖酶活力，所產(chǎn)木聚糖酶能夠?qū)⒛揪厶堑孜锼馍珊?～5個木糖分子的低聚木糖。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，僅有碳源因素對木聚糖酶水解產(chǎn)物種類存在影響，而在其他因素（氮源、培養(yǎng)基初始pH值、料水比、金屬離子）變化條件下，薄層色譜圖均相似，能夠產(chǎn)生5種左右的低聚木糖，原因可能為麩皮和玉米芯中含有木聚糖成分，對木聚糖酶存在一定的誘導(dǎo)作用［13-14］。目前，固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的菌種研究多集中在黑曲霉方面，對康氏木霉的研究很少。前期研究發(fā)現(xiàn)康氏木霉有復(fù)雜的纖維素酶系，可以通過誘導(dǎo)調(diào)控獲得高產(chǎn)量的纖維素酶［15］?？凳夏久沟哪揪厶敲该赶导敖M分發(fā)酵有望通過調(diào)控獲得，但其精細調(diào)控和每個組分酶學(xué)特性有待深入研究。該實驗使用的玉米芯，既是發(fā)酵原料，也是潛在的木聚糖水解底物，這對農(nóng)業(yè)秸稈廢棄物的深度資源化，發(fā)酵渣的肥料化，減少焚燒引起的環(huán)境污染，具有很好的現(xiàn)實意義和市場前景。

［1］COLLINS T，GERDAY C，F(xiàn)ELLER G.Xylanases，xylanases families and extremophilic xylanases［J］.FEMS Microbiol Rev，2005，29（1）:3-23.

［2］高艷秀，陳復(fù)生，丁長河.微生物木聚糖酶及其應(yīng)用［J］.中國釀造，2012，31（3）：10-12.

［3］倪大偉，李瑞云，白愛枝，等.黑曲霉木聚糖酶的同源表達及其高產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（4）：48-53.

［4］萬紅貴，武振軍，蔡恒，等.微生物發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶研究進展［J］.中國生物工程雜志，2010，30（2）：141-146.

［5］葉世超，薛婷，何文錦，等.木聚糖酶的應(yīng)用及其研究進展［J］.中國釀造，2013，32（7）：8-10.

［6］BEG Q K，KAPOOR M，MAHAJAN L.Microbial xylanases and their industrial applications:a review［J］.Appl Microbiol Biot，2001，56（3）: 326-338.

［7］YUAN X，WANG J，YAO H.Feruloyl oligosaccharides stimulate the growth of bifidobacterium［J］.Bifidum Anaerobe，2005，11：225-229.

［8］丁強.飼用木聚糖酶的研究進展及應(yīng)用［J］.制漿造紙工藝，2010，41（4）：18-21.

［9］KIM J C，SIMMINS P H，MULLAN B P，et al.The digestible energy value of wheat for pigs，with special reference to the post-weaned animal［J］. Anim Feed Sci Tech，2005，122（3-4）:257-287.

［10］李敏康，張帆，宋宏新.木霉固態(tài)發(fā)酵麥麩制備低聚木糖的初步研究［J］.中國釀造，2012，31（12）：60-63.

［11］GHOSE T K.Measurement of cellulase activities［J］.Pure Appl Chem，1987，59（2）:257-268.

［12］LIN Y S，CHEN G G，LING M，et al.A method of purification，identification and characterization of β-glucosidase fromTrichoderma koningii AS3.2774［J］.J Microbiol Method，2010，83（1）:74-81.

［13］SINGH S，MADLALA A M，PRIOR B A.Thermomyces lanuginosus: properties of strains and their hemicellulases［J］.FEMS Microbiol Rev，2003，27（1）:3-16.

［14］張姝倩.黑曲霉產(chǎn)木聚糖酶固體發(fā)酵條件研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2013（8）：5-7，11.

［15］林元山.康氏木霉AS3.2774纖維素酶系的誘導(dǎo)、阻遏、純化及鑒定方法研究［D］.南寧：廣西大學(xué)博士論文，2010.

Solid-state fermentation conditions for xylanase production byTrichoderma koningii

FENG Bo1，YIN Yi1，2，YI Xudong1，LIN Yuanshan1，2*
（1.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Changsha Shuidisha Biotechnology Co.，Ltd.，Changsha 410125，China）

By solid-state fermentation，the optimal fermentation process for xylanase production byTrichoderma koningiiwas investigated by single factor experiments and orthogonal experiments as follows∶bran to corncob mass ratio 2∶8 as carbon sources，（NH4）2SO42.5%as nitrogen source，Mn-SO40.25%，solid to liquid ratio 1∶1.5（g∶ml），initial pH in natural state，temperature 30℃and time 6 d.Under this condition，the activity of xylanase byT.koningiireached 11.98 IU/g.The products of xylanase hydrolysis were rich in functional polymeric xylose bonded with 2-5 xylose molecular.

Trichoderma koningii；xylanase；solid-state fermentation；optimization

Q939.9

A

0254-5071（2015）10-0073-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.10.016

2015-09-07

長沙市科技成果轉(zhuǎn)化資金項目資助（K1501194-31）

馮波（1990-），女，碩士研究生，研究方向為生物技術(shù)與工程。

林元山（1969-），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。