田蜜，劉娜，于秋紅，劉裕婷，黃沛力

1. 首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗與測試中心，北京 100069 2. 首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069 3. 環(huán)境毒理學(xué)北京市重點實驗室，北京 100069 4. 山東省食品藥品檢驗研究院，濟(jì)南 250101 5. 北京市豐臺區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京100071

CdTe/ZnSQDs在小鼠腎臟中的藥代動力學(xué)特征

田蜜1，劉娜2,3,4，于秋紅5，劉裕婷5，黃沛力2,3,*

1. 首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗與測試中心，北京 100069 2. 首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069 3. 環(huán)境毒理學(xué)北京市重點實驗室，北京 100069 4. 山東省食品藥品檢驗研究院，濟(jì)南 250101 5. 北京市豐臺區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京100071

為了解CdTe/ZnSQDs(CdTe/ZnS量子點)在小鼠腎臟中的藥代動力學(xué)特征，選擇雄性ICR(Institute of Cancer Research)小鼠為動物模型，每只單次尾靜脈注射5 nmol的CdTe/ZnSQDs(粒徑約為6 nm，最大發(fā)射波長590 nm)。在尾靜脈注射CdTe/ZnSQDs 15 min、1 h、6 h、24 h、72 h、168 h、2 w、4 w和6 w時剖取小鼠的腎臟，消化后使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)檢測其中的Cd(鎘)和Te(碲)含量，Cd和Te在小鼠腎臟中濃度隨時間的變化均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，Cd和Te含量分別在168 h和72 h時達(dá)到峰值(60.42 ± 8.85) ng·g-1和(18.69 ± 0.97) ng·g-1，之后逐漸下降，將二者的含量以摩爾比表示，隨著給藥時間的延長，摩爾(Cd)：摩爾(Te)由2.71:1逐漸變成1.39:1。利用3P87計算Cd和Te在腎臟中的藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cd和Te在腎臟中的Vd(表觀分布體積)分別為(823.14 ± 82.76) g·kg-1和(686.28 ± 53.13) g·kg-1(P < 0.05)；AUC(藥物濃度-時間曲線下面積)分別為(24.48 ± 2.52) μg·g-1·h和(7.41± 0.60) μg·g-1·h(P < 0.01)；CL(清除率)分別為(0.90 ± 0.11) g·kg-1·h-1和(1.02 ± 0.13) g·kg-1·h-1(P > 0.05)；t1/2(半衰期)分別為(617.02± 8.57) h和(458.21 ± 1.85) h(P <0.01)。研究提示Cd和Te在腎臟含量的摩爾比隨時間變化不同，QDs在體內(nèi)發(fā)生了化學(xué)降解；二者的藥代動力學(xué)參數(shù)不同，Cd在腎臟中的代謝速度明顯慢于Te，游離的Cd2+可能引起腎臟毒性。

量子點；小鼠；腎臟；藥代動力學(xué)

量子點(quantum dots, QDs)又稱為半導(dǎo)體納米晶體，是一種直徑為1～100 nm，能夠接受激發(fā)光而產(chǎn)生熒光的納米材料。QDs一般由半導(dǎo)體核心(如CdSe或CdTe)和外殼(如ZnS)組成。核心是QDs產(chǎn)生特征熒光的基礎(chǔ)，直徑通常為3～11 nm[1]，外殼起到保護(hù)核心的作用，避免QDs核心受到雜質(zhì)的影響，從而提高熒光量子產(chǎn)率。由于具有獨特的熒光特性，QDs不僅在光電轉(zhuǎn)化、傳感和發(fā)光二極管研究領(lǐng)域獲得了成功的應(yīng)用[2-3]，還被廣泛地應(yīng)用于生物活體成像、腫瘤示蹤、診斷與治療以及藥物載體、藥物篩選等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[4-5]。由于含有重金屬離子Cd2+，因此QDs的生物學(xué)毒性效應(yīng)及其對環(huán)境、健康的影響成為近年來新的研究熱點。QDs雖然具有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，但是由于生物樣品背景光度值的不確定性，不宜用光信號來對QD進(jìn)行定性和定量分析(血液樣品會導(dǎo)致熒光信號淬滅)。Chen等[6]連續(xù)五天比較熒光分光光度計測定QDs熒光強(qiáng)度和ICP-MS測定Cd2+濃度結(jié)果，表明在體內(nèi)實驗中Cd2+濃度能夠代表QDs含量。ICP-MS因其高靈敏度被用來檢測多種金屬元素，其對Cd的檢測限可以達(dá)到0.1 ppb，且背景干擾較少，直接消化血液或組織樣品后，使用ICP-MS測定111Cd含量，以此作為QDs的代謝特征，這是目前QDs代謝動力學(xué)研究的主要方法[7]。前期的研究表明，量子點易蓄積在肝臟、腎臟、脾臟等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，在腎臟具有明顯的重吸收。腎臟是人體調(diào)節(jié)水鹽代謝、排泄代謝產(chǎn)物的重要器官，它的基本功能是生成尿液，借以清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物，同時經(jīng)重吸收功能保留水份及其他有用物質(zhì)。研究和掌握QDs在腎臟中的代謝特點是指導(dǎo)其實際應(yīng)用與安全性評價的理論基礎(chǔ)。本實驗以雄性ICR小鼠為動物模型，采用尾靜脈給藥方式，在系統(tǒng)研究其血液動力學(xué)和組織分布的基礎(chǔ)上[8]，通過測定Cd和Te在其主要蓄積靶器官腎臟的濃度，計算各自的藥代動力學(xué)參數(shù)，比較參數(shù)的異同，揭示QDs在體內(nèi)的不穩(wěn)定性，研究其在腎臟的代謝動力學(xué)特征，為進(jìn)一步研究CdTe/ZnSQDs的體內(nèi)毒性提供了實驗數(shù)據(jù)。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1儀器與試劑

Milli-Q超純水機(jī)(美國Milipore公司)，AX200電子分析天平(日本Shimadzu公司)，DHG-9123A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密儀器廠)，DB-3C型控溫電加熱板(泉州萬達(dá)實驗設(shè)備廠)，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(7500ce，美國Agilent公司)。CdTe/ZnSQDs(紅色)：由浙江大學(xué)制備。Cd2+、穩(wěn)定劑和HTe-的摩爾比為1:1.2:0.25。QDs粒徑約為6 nm，在激發(fā)波長412 nm處，最大發(fā)射波長590 nm。碲、鎘、銦標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 mg·mL-1)購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；濃硝酸、雙氧水(GR)購于北京化學(xué)試劑公司；高純氬氣(99.996%)購于北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司。

1.2試劑配制

1.2.1CdTe/ZnSQDs注射液的配制

CdTe/ZnSQDs采用無菌生理鹽水稀釋懸浮至濃度為50 nmol·mL-1的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，每只小鼠尾靜脈注射0.1 mL的CdTe/ZnSQDs生理鹽水懸浮液。

1.2.2Cd和Te元素應(yīng)用液及混標(biāo)的配制

Cd的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(10 μg·mL-1)：準(zhǔn)確移取1.0 mg·mL-1的Cd元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.50 mL于50 mL的容量瓶，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的硝酸定容至刻度，搖勻。

Te的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(10 μg·mL-1)：準(zhǔn)確移取1.0 mg·mL-1的Te元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.50 mL于50 mL的容量瓶，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的硝酸定容至刻度，搖勻。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：將Cd的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和Te的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的硝酸依次倍比稀釋為50 mL混合標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，即100 ng·mL-1、50 ng·mL-1、10 ng·mL-1、5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、0 ng·mL-1(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的空白硝酸溶液)。

1.2.3銦內(nèi)標(biāo)溶液的配制

In的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 μg·mL-1)：準(zhǔn)確移取1.0 mg·mL-1的In元素標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.50 mL于50 mL的容量瓶，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的硝酸定容至刻度，搖勻。

In的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(500 ng·mL-1)：準(zhǔn)確移取10 μg·mL-1的In元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.050 mL于10 mL的容量瓶，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的硝酸定容至刻度，搖勻。

1.3實驗動物及分組

健康雄性清潔級ICR小鼠40只，體重23.8～26.8 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)。動物合格證號：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)SCXK-(軍)2007-004。飼養(yǎng)在溫度為18 ℃～22 ℃、相對濕度為(55%±10%)的動物房內(nèi)，用滅菌顆粒料和純凈水喂養(yǎng)。正式實驗前，小鼠有一周以上的時間適應(yīng)本實驗室的飼養(yǎng)條件。將小鼠隨機(jī)分成10組，每組4只，每只小鼠尾靜脈注射濃度為50 nmol·mL-1的CdTe/ZnSQDs溶液0.1 mL，使得最終QDs的給藥濃度為5 nmol/只，分別在給藥后0.25 h、1 h、6 h、24 h、72 h、168 h、2 w、4 w、6 w斷頭處死小鼠。給藥后小鼠狀態(tài)良好，飲水量、進(jìn)食量，較之前無明顯變化。

1.4樣品處理及測定

取出一個腎臟組織(0.1～0.2 g)于10 mL小燒杯中，加1～2 mL硝酸與過氧化氫混合液(V∶V= 4∶1)浸泡15～20 min，將小燒杯置于電熱板上進(jìn)行消化，反應(yīng)平緩進(jìn)行至腎臟組織消失，杯底呈白色粉末或無色。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的HNO3溶液定容至1.5 mL。用與樣品相同的方法處理空白對照。實驗用銦(115In)溶液作為內(nèi)標(biāo)元素。ICP-MS檢測儀器參數(shù)：等離子功率1 530 W；載氣流量1.23 L·min-1；采樣深度8.0 mm；S/C溫度2 ℃；霧化器泵0.1 rps；模式反應(yīng)池氦碰撞模式；He氣流量4 mL·min-1。

1.5藥代動力學(xué)參數(shù)

Cd和Te在腎臟中的藥代動力學(xué)參數(shù)采用3P87藥代動力學(xué)軟件進(jìn)行分析，分別計算出表觀分布容積(Vd)：藥物在體內(nèi)達(dá)到動態(tài)平衡時，體內(nèi)藥量與血藥濃度的比值，反映藥物分布的廣泛程度及與組織結(jié)合的程度；血藥濃度曲線下面積(AUC)：血藥濃度隨時間變化的積分值，它與吸收入體循環(huán)的藥量成正比，反映進(jìn)入體循環(huán)藥物的相對量；血漿清除率(CL)：藥物自體內(nèi)清除的一個重要指標(biāo)，是肝、腎清除率的總和；半衰期(t1/2)：藥物在血漿中最高濃度降低一半所需的時間。所有實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用SSPS 13.0軟件(SPSS Inc.)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用配對t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，P <0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果和討論(Results and discussion)

2.1Cd和Te在小鼠腎臟中的含量

由圖可見，Cd和Te在小鼠腎臟中含量隨時間的變化均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，Cd在168 h時含量達(dá)到最高值(60.42 ± 8.85) ng·g-1，之后逐漸下降，在6 w時含量降為(3.51 ± 0.03) ng·g-1；而Te在腎臟中的分布則是在72 h時達(dá)到最高峰為(18.69 ± 0.97) ng·g-1，6 w時降至(0.79 ± 0.07) ng·g-1。將腎臟中Cd和Te的含量以摩爾比表示，發(fā)現(xiàn)隨著給藥時間的延長，Cd和Te的摩爾比由最初的2.71:1逐漸變成1.94:1，直至1.39:1，進(jìn)一步說明QDs在小鼠體內(nèi)部分發(fā)生了降解。Cd在腎臟中的濃度高于Te。：

圖1　Cd和Te在小鼠腎臟中的含量變化(n=4)Fig. 1　The content changes of Cd and Te in the mouse kidney (n=4)

2.2藥代動力學(xué)參數(shù)

Cd和Te在腎臟中的藥代動力學(xué)參數(shù)(PK Parameters)如表1。Cd和Te在腎臟中表觀分布容積分別為(823.14 ± 82.76)和(686.28 ± 53.13)(P < 0.05)，血藥濃度曲線下面積分別為(24.48 ± 2.52)和(7.41± 0.60)(P < 0.01)，說明Cd在腎臟分布遠(yuǎn)大于Te，腎臟對Cd的吸收程度遠(yuǎn)高于Te；半衰期分別為(617.02± 8.57)(約26 d)和(458.21 ± 1.85)(20 d)(P < 0.01)，表明Cd的生物半衰期長，以上數(shù)據(jù)提示Cd在腎臟蓄積量大、存時長，導(dǎo)致其在腎臟中的代謝速度明顯慢于Te，在6 w時仍能檢測到Cd和Te，有可能是因為QDs在體內(nèi)發(fā)生了聚集，QDs的粒徑變大，使得其從腎臟清除的能力變低。

有學(xué)者認(rèn)為CdTe/ZnSQDs中的Cd通過化學(xué)鍵與Te結(jié)合，本身不帶電荷，沒有生物活性，是安全無毒的。Chen等[6]配制pH 7.4和pH 4.8的緩沖液，模擬血液和腎小管的存在環(huán)境，觀察CdSeS/SiO2QDs的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)CdSeS/SiO2QDs的最大發(fā)射波長和溶液中Cd2+濃度均沒有明顯改變，由此推斷CdSeS/SiO2QDs在血液和腎臟中可以穩(wěn)定存在。然而Fitzpatrick等[9]研究PEG 5000包被CdSe/ZnSQDs在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)CdSe/ZnSQDs的熒光信號出現(xiàn)了藍(lán)移，即CdSe/ZnSQDs發(fā)生了降解。誠然，體內(nèi)實驗存在代謝、排泄問題，不同于體外實驗，以體外實驗結(jié)果外推體內(nèi)實驗結(jié)果是不準(zhǔn)確的。本實驗結(jié)果進(jìn)一步表明，量子點在體內(nèi)可以降解。Cho等[10]通過體外實驗，認(rèn)為量子點毒性的產(chǎn)生是Cd2+和ROS的共同作用結(jié)果；Derfus等[11]認(rèn)為QDs毒性與氧化過程中重金屬Cd2+的釋放直接相關(guān)；量子點中含有Cd2+、Te2-和Se2-等重金屬離子對機(jī)體的腎臟和肺都有毒性[12-14]。這些毒性重金屬離子將使QDs在生物體內(nèi)的毒性效果被放大，進(jìn)而影響其臨床應(yīng)用。

表1　Cd和Te的藥代動力學(xué)參數(shù)(n=4)

注：與Te對應(yīng)指標(biāo)相比，﹡P < 0.05，﹡﹡P < 0.01。

Note: compared with Te,﹡P < 0.05,﹡﹡P < 0.01.

通訊作者簡介：黃沛力(1963—)，女，首都醫(yī)科大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師。長期從事納米材料檢測技術(shù)與生物體內(nèi)化學(xué)穩(wěn)定性研究，先后參與和承擔(dān)國家“863”項目、國家自然科學(xué)基金重點/面上項目、北京市教委科技計劃面上項目等20余項，主編、副主編和參編教材10余部。在Particle and Fibre Toxicology等雜志發(fā)表SCI論文20余篇，申請國家發(fā)明專利2項。曾獲北京市中青年骨干教師、首都醫(yī)科大學(xué)“優(yōu)秀教師”等多項榮譽(yù)稱號。

[1]Bailey R E, Smith A M, Nie S M. Quantum dots in biology and medicine [J]. Physica E: Low-dimensional Systems and Nanostructures, 2004, 25(1): 1-12

[2]Michalet X, Pinaud F F, Bentolila L A, et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging and diagnostics [J]. Science, 2005, 307(5709): 538-544

[3]Medintz I L, Mattoussi H, Uyeda T, et al. Quantum dots bioconjugates for imaging, labeling and sensing [J]. Nature Materials, 2005, 4: 435-446

[4]Dahan M, Levi S, Luccardini C, et al. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking [J]. Science, 2003, 302(5644): 442-445

[5]Jaiswal J K, Mattoussi H, Mauro J M, et al. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates [J]. Nature Biotechnology, 2003, 21(1): 47-51

[6]Chen Z, Chen H, Meng H, et al. Bio-distribution and metabolic paths of silica coated CdSeS quantum dots [J]. Toxicology and Applied Phamacology, 2008, 230(3): 364-371

[7]唐蕾, 張春玲, 宋光明, 等. 小鼠對量子點的透皮吸收和代謝[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2012, 39(2): 188-193

Tang L, Zhang C L, Song G M, et al.Transdermal deliver through in vivo mouse skin and metabolic path of quantum dots [J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2012, 39(2): 188-193 (in Chinese)

[8]Han Y, Xie G Y, Sun Z W, et al. Plasma kinetics and biodistribution of water-soluble CdTe quantum dots in mice: A comparison between Cd and Te [J]. Journal of Nanoparticle Research, 2011, 13(10): 5373-5380

[9]Fitzpatrick J A J, Andreko S K, Ernst L A, et al. Long-term persistence and spectral blue shifting of quantum dots in vivo [J]. Nano Letters, 2009, 9: 2736 - 2741

[10]Cho S J, Maysinger D, Jain M, et al. Long-term exposure to CdTe quantum dots causes functional impairments in live cells [J]. Langmuir, 2007, 23: 1974-1980

[11]Derfus A M, Chan W C W, Bhatia S N. Probing the cytotoxicity of semiconductor quantum dots [J]. Nano Letters, 2004, 4(1): 11-18

[12]Clapp A R, Medintz I L, Mauro J M, et al. Fluorescence resonance energy transfer between quantum dot donors and dye-labeled protein acceptors [J] . Journal of the American Chemical Society, 2004, 126: 301-310

[13]Medintz I L, Clapp A R, Mattoussi H, et al. Self-assembled nanoscale biosensors based on quantum dot FRET donors [J]. Nature Materials, 2003, 2(9): 630-638

[14]Wang S P, Mamedova N, Kotov N A, et al. Antigen/antibody immunocomplex from CdTe nanoparticle bioconjugates [J]. Nano Letters, 2002, 2(8): 817-822

◆

Pharmacokinetic Characteristics of CdTe/ZnSQDs in Kidney of the Mice

Tian Mi1, Liu Na2,3,4, Yu Qiuhong5, Liu Yuting5, Huang Peili2,3,*

1. Capital Medical University Core Facilities Center, Beijing 100069, China 2. School of Public Health, Capital Medical University, Beijing 100069, China 3. Beijing Key Laboratory of Environmental Toxicology, Beijing 100069, China 4. Shangdong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101, China 5. Center for Disease Control and Prevention of Fengtai District, Beijing 100071, China

4 November 2014accepted 25 February 2015

In order to understand the pharmacokinetic characteristics of CdTe/ZnSQDs in kidney, male ICR mice were intravenously given a single dose (5 nmol/mouse) of CdTe/ZnSQDs (QDs are approximately 6 nm in diameter and have maximal emission at 590 nm). After intravenous injection, kidneys of the mice were harvested at 15 min, 1 h, 6 h, 24 h, 72 h, 168 h, 2 w, 4 w and 6 w from the mice, the contents of Cd and Te in the kidney were detected by ICP-MS, The concentrations of Cd and Te changed over time in mouse kidney, with a trend to increase at first followed by a reduction. The concentration of Cd and Te reached their peak values of (60.42 ± 8.85) ng·g-1and (18.69 ± 0.97) ng·g-1at 168 h and 72 h respectively. With the duration of administration time, both of two indicate in the molar ratio, n (Cd): n (Te) changes from 2.71:1 to 1.39:1 gradually. The pharmacokinetic parameters of Cd and Te in kidney were calculated. Results showed that pharmacokinetic parameters of Cd and Te in kidney were dramatically different, in which the apparent volume of distribution of Cd and Te were (823.14 ± 82.76) g·kg-1and (686.28 ± 53.13) g·kg-1(P < 0.05); the area under the plasma concentration-time profiles were (24.48 ± 2.52) μg·g-1·h and (7.41± 0.60) μg·g-1·h (P < 0.01 ); the clearance were (0.90 ± 0.11) g·kg-1·h-1and (1.02 ± 0.13) g·kg-1·h-1(P > 0.05.); and the half-life were (617.02± 8.57) h and (458.21 ± 1.85) h (P <0.01), respectively. The molar ratio of Cd and Te in kidney changed over time, implying the occurrence of chemical degradation of QDs in vivo. The pharmacokinetic parameters of both elements are different, as the degradation of Cd is obviously faster than that of Te in kidney. The free Cd2+may cause renal toxicity.

quantum dots; mice; kidney; pharmacokinetics

國家自然科學(xué)基金(81273131,81573201)；北京市教育委員會科技計劃重點項目(KZ201510025027)

田蜜(1968-)，女，主管技師，研究方向為毒理學(xué)，E-mail: mitian1999@126.com；

Corresponding author)， E-mail: huangpl@ccmu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20141104001

2014-11-04 錄用日期：2015-02-15

1673-5897(2015)6-264-05

X171.5

A

田蜜，劉娜，于秋紅, 等. CdTe/ZnSQDs在小鼠腎臟中的藥代動力學(xué)特征[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2015, 10(6): 264-268

Tian M, Liu N, Yu Q H, et al. Pharmacokinetic characteristics of CdTe/ZnSQDs in kidney of the mice [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 264-268 (in Chinese)