李曉建，姜行康，高明，孔佑勝，潘東亮，李寧枕，劉思金

1. 北京大學(xué)首鋼醫(yī)院泌尿外科，北京100144 2. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085 3. 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津3002111 4. 北京大學(xué)首鋼醫(yī)院檢驗科，北京100144

非毒性劑量重金屬銻通過改變細胞脂代謝促進前列腺癌進展

李曉建1,2，姜行康2,3，高明2，孔佑勝4，潘東亮1,*，李寧枕1,#，劉思金2

1. 北京大學(xué)首鋼醫(yī)院泌尿外科，北京100144 2. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085 3. 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津3002111 4. 北京大學(xué)首鋼醫(yī)院檢驗科，北京100144

本文旨在檢測健康人群與前列腺癌患者血清中重金屬銻的含量，并對重金屬銻在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用和相關(guān)機制進行初步探索。本實驗使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)對健康人群和前列腺癌患者血清中重金屬銻的含量進行了檢測；此外，分別通過MTT和Alamar-Blue方法對于重金屬銻對人前列腺癌PC-3細胞的毒性效應(yīng)進行了評價，并進一步探討了非毒性劑量的重金屬銻對前列腺癌細胞增殖能力(細胞計數(shù)及克隆形成實驗)及脂類代謝過程(細胞內(nèi)甘油三酯)的影響。研究結(jié)果顯示:重金屬銻在前列腺癌組患者血清中含量明顯高于健康人群組且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；毒性實驗結(jié)果表明高劑量的重金屬銻能夠顯著抑制細胞活力且呈濃度依賴型方式，而非毒性劑量重金屬銻能夠顯著促進前列腺癌細胞增殖，并導(dǎo)致細胞內(nèi)甘油三酯的含量增加(P< 0.05)。綜上所述，重金屬銻在前列腺癌患者血清中具有相對較高水平，其機制可能是通過影響細胞脂類代謝從而促進前列腺癌的進展，這將對未來前列腺癌的預(yù)防和治療提供一定的理論依據(jù)。

重金屬；銻；前列腺癌；脂代謝

前列腺癌是老年男性群體中最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)2014年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，前列腺癌在美國的發(fā)病率約為27%，遠高于其他惡性腫瘤，同時其死亡率約為10%，在惡性腫瘤性疾病導(dǎo)致的男性死亡率中排行第二位[1]。在中國，雖然前列腺癌的發(fā)病率相對較低，但仍有逐年增加的趨勢，如，1988-1992、1993-1997、1998-2002年間我國的前列腺癌發(fā)病率分別為1.96/10萬、3.09/10萬、4.36/10萬人次[2-3]。目前前列腺癌發(fā)病機制主要歸納為：激素水平失衡、氧化應(yīng)激、環(huán)境因素、衰老、炎癥及遺傳等因素[4]。近些年來，隨著科技的發(fā)展和社會工業(yè)化水平的不斷加快，環(huán)境污染對人類健康的影響受到大家越來越多的關(guān)注。其中重金屬對人類惡性腫瘤的影響也逐漸受到科學(xué)家的重視[5-8]。已有報道顯示，重金屬與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。但是，目前對重金屬暴露與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究仍較少，其機制有待于進一步探索。

本實驗借助電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS, inductively coupled plasma mass spectrometry)對健康人群以及前列腺癌患者血清中重金屬銻(Sb, antimony)含量進行檢測，此外，通過非毒性劑量重金屬銻對前列腺癌細胞增殖以及細胞內(nèi)脂類代謝進行評價，為重金屬銻對促進前列腺癌進展的關(guān)系提供相應(yīng)理論依據(jù)。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1試劑與材料

2013年1月至2014年5月北京大學(xué)首鋼醫(yī)院泌尿外科收治前列腺癌患者(PCa, prostate cancer)90例，年齡56～92歲，平均年齡75歲。健康對照組(HC, healthy control)均來自于體檢中心共60例，年齡22～55歲，平均年齡44歲。標(biāo)本獲取及研究應(yīng)用經(jīng)患者知情同意和醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

真空采血管(Beckton-Dickinson，美國)，電阻率≥18.2 MΩ·cm的超純水取自Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，美國)，65%分析純硝酸(Merk，德國)，30%優(yōu)純級H2O2、分析純甲醛溶液(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，混合元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100 μg·mL-1)(Thermo Fisher，美國)，釔(Y)和銦(In)內(nèi)標(biāo)儲備液(中國地質(zhì)科學(xué)院)，調(diào)諧液(Agilent，美國)，聚四氟乙烯消解管(CEM，美國)。

人前列腺癌細胞株P(guān)C-3(上海中科院細胞庫)，RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，美國)，10%胎牛血清(FBS)、100 U·mL-1青霉素-鏈霉素(P/S)、0.25%胰蛋白酶(trypsin)購于美國Hyclone公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、結(jié)晶紫染色液購于北京索萊寶公司，酒石酸銻鉀(APT)(天津科密歐)，甘油三酯試劑盒(南京建成)。

1.2實驗儀器

MARS-X微波消解儀(CEM，美國)，趕酸電熱板(南京瑞尼克科技開發(fā)有限公司)，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀iCAP Qc(Thermo Fisher，美國)，蔡司金相顯微鏡Axio Scope A1(Carl Zeiss，德國)，光柵型多功能微孔板讀數(shù)儀(Thermo Scientific，美國)，Thermo Scientific CL31多用途離心機(Thermo Scientific，美國)。

1.3實驗方法

1.3.1血清樣本收集

醫(yī)院專人負責(zé)收集病人靜脈血并置于含有抗凝劑(肝素鈉)的10 mL真空采血管中，靜置30 min后放入離心機，4 000 g離心30 min，將上清(即血清)轉(zhuǎn)入Eppendorf管內(nèi)，置于-80 ℃冰箱長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2血清消解并測定銻含量

血清充分解凍后，用移液器準(zhǔn)確吸取400 μL血清樣品并加入聚四氟乙烯消解管中，加入3 mL 65%硝酸和3 mL 30%H2O2，蓋上密封蓋，放入微波消解儀中，微波消解儀的功率和加熱時間如表1所示。消解結(jié)束后，將聚四氟乙烯消解管置于趕酸電熱板上，調(diào)節(jié)趕酸溫度至200 ℃，待酸液趕至0.5 mL時停止趕酸，冷卻至室溫，將消解管內(nèi)的消解液移至5 mL離心管內(nèi)，并定容至10 mL，混勻后使用ICP-MS檢測。同時做空白對照，即取400 μL超純水同前述處理方法后所得溶液。

1.3.3細胞培養(yǎng)

人前列腺癌細胞PC-3培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，并添加10%胎牛血清、1%100 U·mL-1青霉素-鏈霉素，置于37 ℃恒溫、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3.4細胞毒性試驗

酒石酸銻鉀(APT, antimony potassium tartrate)是一種含銻的水溶性藥物，臨床上常用作抗寄生蟲藥物等。MTT和Alamar-Blue實驗[10]用于APT的細胞毒性檢測。PC-3細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后進行細胞計數(shù)，以5 000個·孔-1的細胞密度接種于96孔板內(nèi)。細胞貼壁后，加入不同濃度的酒石酸銻鉀并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL 5 mg·mL-1的MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，10 min后，利用多功能微孔板讀數(shù)儀在540 nm處檢測吸光值。或者在上述APT暴露后的PC-3細胞中加入10 μL·孔-110% Alamar-Blue溶液，37 ℃避光孵育2 h，利用多功能微孔板讀數(shù)儀在激發(fā)波長為530 nm和發(fā)射波長為590 nm處檢測熒光強度。

1.3.5細胞單克隆形成實驗

PC-3細胞以600個·孔-1的密度接種于6孔板內(nèi)，待貼壁后加入不同濃度的酒石酸銻鉀。根據(jù)Wang等[11-12]的方法進行后續(xù)操作。

1.3.6細胞計數(shù)

PC-3細胞以5 000個·孔-1的密度接種于24孔板內(nèi)，貼壁后加入不同濃度(非毒性劑量)的APT，分別于24 h和72 h后消化細胞并計數(shù)。

1.3.7細胞內(nèi)甘油三酯濃度檢測

將PC-3細胞接種于6孔板后，加入不同濃度(非毒性劑量)的APT并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用南京建成公司的甘油三酯檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)甘油三酯含量。

1.4數(shù)據(jù)分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以t檢驗比較兩組的平均值；以O(shè)ne Way-Anova進行多組數(shù)據(jù)的方差分析；數(shù)據(jù)以x±s形式表示。P<0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果(Results)

2.1血清檢測結(jié)果

通過ICP-MS檢測后發(fā)現(xiàn)，PCa組血清中重金屬銻的含量明顯高于HC組(約增加20%)(6.23 μg·L-1，以及5.05 μg·L-1，P<0.05，圖1)。本次檢測的加

圖1　血清中銻的檢測結(jié)果(HC: healthy control; PCa: prostate cancer)Fig. 1　 Content of antimony in serum(HC: healthy control; PCa: prostate cancer)

表1　微波消解程序

標(biāo)回收率為85%～115%，元素的RSD介于1.7%～10.2%，表明檢測方法精度良好。

2.2細胞毒性實驗

采用MTT法和Alamar-Blue法檢測不同藥物濃度刺激下的細胞毒性。結(jié)果表明，APT的半數(shù)致死量(IC50)約為32 μg·mL-1；在APT濃度為0.5 μg·mL-1與2 μg·mL-1時，APT對PC-3細胞的活力沒有顯著影響，當(dāng)APT濃度大于8 μg·mL-1時，PC-3細胞的活力受到明顯抑制(P<0.05，圖2)。MTT法和Alamar-Blue法的檢測結(jié)果基本一致。

2.3細胞計數(shù)

分別采用0.5 μg·mL-1和2 μg·mL-1APT(非毒性劑量)處理PC-3細胞24 h和72 h后進行細胞計數(shù)，結(jié)果顯示0.5 μg·mL-1和2 μg·mL-1APT暴露72 h后暴露組細胞數(shù)量明顯多于對照組，增幅分別為20%和26%(P<0.05)(圖3)。

圖2　MTT法和Alamar-Blue法檢測重酒石酸銻鉀對PC-3細胞活力的毒性效應(yīng)Fig.2　The toxicity effect on PC-3 cell viability detected by MTTand Alamar-Blue assay induced by potassium antimony tartrate

圖3　酒石酸銻鉀對PC-3細胞暴露后的細胞計數(shù)結(jié)果Fig. 3　Result of cell counting of PC-3 cells after the exposure of potassium antimony tartrate

2.4細胞單克隆形成實驗

腫瘤細胞單克隆形成實驗結(jié)果表明，0.5 μg·mL-1APT處理PC-3細胞96 h后，細胞克隆形成能力與對照組相比顯著增強(體積明顯增大且細胞數(shù)量明顯增多)(圖4)。

圖4　酒石酸銻鉀對PC-3細胞克隆形成能力的影響(200×)Fig. 4　Effect on PC-3 cells colony formation capability induced by potassium antimony tartrate (200×)

圖5　酒石酸銻鉀對PC-3細胞內(nèi)甘油三酯水平的影響Fig. 5　The production of intracellular triglyceride of PC-3 cells induced by potassium antimony tartrate

3　討論(Discussion)

近些年來，隨著生活水平的提高及生活方式的改變，我國男性前列腺癌的發(fā)病率逐年增高。環(huán)境污染在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用也日益受到人們的關(guān)注，其中重金屬誘發(fā)前列腺癌的相關(guān)機制成為研究熱點[5-8]。目前為止，國際癌癥研究機構(gòu)(IARC，international agency for research on cancer)證實多種重金屬物質(zhì)能夠誘發(fā)癌癥的發(fā)生發(fā)展[13]，如鎘的職業(yè)暴露與前列腺癌等多種人類惡性腫瘤性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[14-15]。類似的研究還包括砷、銅、鈷、錳、鎳等[16-23]。上述幾種重金屬暴露能夠通過不同的途徑促使前列腺上皮細胞發(fā)生惡化：如通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達而導(dǎo)致正常的前列腺上皮細胞增殖失控；改變癌變的前列腺上皮細胞表面激素受體數(shù)量進而促進細胞增殖[24-29]；以及改變正常前列腺上皮細胞基因組的表觀修飾而引發(fā)其惡性轉(zhuǎn)化[30-31]等。本實驗通過對健康人群和前列腺癌患者血清中重金屬含量進行檢測后發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者血清中重金屬銻的含量顯著高于健康對照組(P<0.05)，表明重金屬銻可能與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展存在密切相關(guān)。

銻是一種在地球上廣泛存在的重金屬元素，主要以合金、氧化物、硫化物以及氫氧化物等形式分布于地殼及水體中[32-33]。此外，銻也是世界上產(chǎn)量最大的經(jīng)濟價值最高的重金屬之一，并廣泛應(yīng)用于塑料、紡織品、橡膠制品、藥品、剎車片、半導(dǎo)體元件、電池等產(chǎn)品的制造[34]。伴隨著人類采礦和工業(yè)生產(chǎn)等活動，越來越多的銻也被釋放到環(huán)境中，極大地增加了人類的暴露風(fēng)險。目前，銻與其化合物已被歐盟和美國環(huán)境保護局(EPA，environmental protection agency)列為最受關(guān)注的環(huán)境污染物[35-36]。銻的化合物具有致癌風(fēng)險，并被國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)列為可能的致癌物質(zhì)[37]。水溶性的銻化合物污染物常見于礦場、射擊場及相應(yīng)的道路旁邊[38-40]。銻也常用于白血病[41]、寄生蟲病[42]等疾病的治療。目前，銻和前列腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究仍未見明確報道。

本實驗選取一種水溶性含銻化合物(酒石酸銻鉀)對于重金屬銻對前列腺癌發(fā)生發(fā)展機制進行初步探索。首先分別通過MTT和Alamar-Blue實驗篩選對人前列腺癌細胞PC-3活力沒有顯著毒性的藥物濃度，進而采用非毒性劑量的APT藥物暴露PC-3細胞后檢測細胞增殖及克隆形成能力。結(jié)果顯示在0.5 μg·mL-1和2 μg·mL-1APT暴露72 h后PC-3細胞增殖(細胞計數(shù))顯著增加，96 h后細胞克隆形成能力(克隆形成)亦顯著增強。表明低劑量、長期暴露重金屬銻能夠促進前列腺癌細胞的增殖，提示非毒性劑量重金屬銻可能對前列腺癌的進展有一定的促進作用。

細胞的能量代謝方式分為有氧氧化和無氧酵解2種[43]。非腫瘤細胞大多以有氧氧化為主要的代謝方式，而腫瘤細胞以無氧酵解為主[44]。在腫瘤細胞內(nèi)，脂類氧化是ATP產(chǎn)生的主要來源[45]。檢測細胞內(nèi)甘油三酯濃度的改變能夠反映細胞脂類代謝方式的變化。將0.5 μg·mL-1和2 μg·mL-1APT暴露于PC-3細胞培養(yǎng)基中72 h后，結(jié)果顯示APT暴露組細胞內(nèi)甘油三酯的含量比對照組增加，增加量分別為45%和72%。因此我們推測，重金屬銻可能通過改變細胞內(nèi)的脂類代謝的方式進而增加其ATP產(chǎn)量，進而促進前列腺癌細胞的增殖。

然而，本文仍然存在不足。首先，納入的兩組人群中年齡存在較大差異，不可避免地存在混雜因素的干擾；其次，本文僅初步探討了健康人群和前列腺癌患者血清中重金屬銻的含量，而對于前列腺癌組內(nèi)是否激素依賴或不同Gleason分級之間重金屬銻含量的差異并未做深入分析；另外，細胞實驗方面，僅選用最常用的細胞系PC-3說明重金屬銻和前列腺癌進展的機制進行初步探索，并未利用其它細胞系(如RWPE-1、LNCaP等)深入探討其激素非依賴、高惡性或轉(zhuǎn)移等其他特性；最后，在關(guān)于細胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)的檢測中，由于我們只是檢測了銻暴露后的前列腺癌細胞內(nèi)的脂代謝過程的變化，關(guān)于糖代謝和氨基酸代謝的過程是否也會受此影響是我們在以后的研究中需要關(guān)注的問題之一。

綜上所述，本實驗通過檢測前列腺癌患者和健康人群血清中重金屬含量，發(fā)現(xiàn)重金屬銻在前列腺癌患者血清中的含量顯著高于健康人群。此外，細胞實驗表明非毒性劑量的重金屬銻能夠明顯促進前列腺癌細胞增殖，而這種效應(yīng)可能是通過細胞內(nèi)脂代謝方式的改變所實現(xiàn)的。

致謝：感謝中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心徐明老師在文章修改中給予的幫助。

通訊作者簡介：潘東亮(1971—)，男，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，主要研究方向泌尿外科學(xué)，在國內(nèi)外學(xué)術(shù)雜志發(fā)表過50多篇文章。

共同通訊作者簡介：李寧忱(1964—)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要研究方向泌尿外科學(xué)，發(fā)表過多篇國內(nèi)外學(xué)術(shù)雜志文章。

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Non-toxic Dose of Antimony Exposure Could Enhance the Intracellular Energy Metabolism and Promote Prostate Cancer Progression

Li Xiaojian1,2, Jiang Xingkang2,3, Gao Ming2, Kong Yousheng4, Pan Dongliang1,*, Li Ningchen1,#, Liu Sijin2

1. Department of Urology, Peking University Shougang Hospital, Beijing 100144, China 2. Research Center for Eco-Environmental Science, Chinese Academy of Science, Beijing 100085, China 3. Department of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Institute of Urology, Tianjin 300211, China 4. Department of Clinical Laboratory, Peking University Shougang Hospital, Beijing 100144, China

27 March 2015accepted 18 May 2015

This article was aimed to detect antimony content in the serum of healthy controls (HC) and prostate cancer (PCa) patients, and investigate the role and molecular mechanisms of antimony-induced PCa progression. We analyzed the concentration of antimony in the serum of HC and PCa patients with ICP-MS, and evaluated the toxicity effect of antimony on PC3 cells by MTT and Alamar-blue assay. In addition, the cell proliferation (cell counting and colony formation tests) and lipid metabolism rates (determined by intracellular triglyceride production) of PC-3 cells in response to non-toxic dose of antimony exposures were also analyzed. And our results showed that the serum concentration of antimony in PCa patients were significantly higher than those in healthy controls (P<0.05), and high dose of antimony could markedly inhibit cell viability in a dose dependent manner. However, cell proliferation rates and intracellular triglyceride levels of PC-3 cells were all obviously enhanced in response to non-toxic dose of antimony (P<0.05). Taken together, our results suggested that serum antimony content was relatively higher in PCa patients than in those of healthy controls, and the mechanism may be attributed to that accelerated intracellular lipid metabolism (especially to triglyceride metabolism) rate promoted the progression of PCa when in response to antimony. Thus, our results may provide a promising clue for the prevention and treatment of PCa in the future.Keywords: heavy metals; antimony; prostate cancer; lipid metabolism

中國科學(xué)院環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點實驗室開放基金(KF2011-12)

李曉建(1986-)，男，碩士，研究方向為泌尿外科學(xué)，E-mail: xiaojianlee3@126.com；

Corresponding author)， E-mail: dongliangpan@hotmail.com

#共同通訊作者(Corresponding author)， E-mail: ningchenli@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150327018

2015-03-27錄用日期：2015-05-18

1673-5897(2015)6-129-07

X171.5

A

李曉建, 姜行康, 高明, 等. 非毒性劑量重金屬銻通過改變細胞脂代謝促進前列腺癌進展[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2015, 10(6): 129-135

Li X J, Jiang X K, Gao M, et al. Non-toxic dose of antimony exposure could enhance the intracellular energy metabolism and promote prostate cancer progression [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 129-135 (in Chinese)