劉伶俐，伍遠(yuǎn)安，洪 波，李傳武，劉 麗，肖 維，李小玲，陳湘藝，黃向榮

（湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南 長(zhǎng)沙410153）

苯并（a）芘簡(jiǎn)稱Bap，是多環(huán)芳烴類化合物(PAHs)的代表，具有多個(gè)同分異構(gòu)體，他的產(chǎn)生機(jī)理是由于食品中有機(jī)成分在高溫缺氧條件下裂解產(chǎn)生碳?xì)渥杂苫Y(jié)合成乙炔，最終轉(zhuǎn)化為苯并（a）芘[1]?，F(xiàn)已證實(shí)為持久性難降解有機(jī)污染物，對(duì)人類健康和環(huán)境造成極大危害，被列為廣泛關(guān)注的影響食品安全的物質(zhì)之一。因此快速、準(zhǔn)確地分析煙熏魚(yú)中苯并(a)芘殘留物是食品安全和保障人體健康的迫切需求。

煙熏魚(yú)中苯并（a）芘的測(cè)定方法還沒(méi)有執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，目前其檢測(cè)方法主要為高效液相色譜法[2]、薄層層析法[3]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[4]，常用的前處理技術(shù)主要為薄層層析法[5]、Triton X-100 法[6]、微柱管法[7]，而現(xiàn)有的文獻(xiàn)及方法多存在前處理時(shí)間長(zhǎng)，溶劑用量大，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣等諸多問(wèn)題。由于煙熏魚(yú)的基質(zhì)成分較為復(fù)雜，樣品處理稍有不當(dāng)，極易造成試樣中的苯并（a）芘分析損失和干擾，樣品的前處理十分重要。試驗(yàn)嘗試采用全自動(dòng)凝膠凈化系統(tǒng)凈化，利用系統(tǒng)良好的重現(xiàn)性和安全性，結(jié)合超高效液相色譜儀快速、穩(wěn)定的分析能力，制定一個(gè)適用于煙熏魚(yú)中苯并(a)芘殘留物的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器：WatersACQuity，美國(guó)Waters 公司；平行蒸發(fā)器：Q-101，瑞士Buchi 公司；高速冷凍離心機(jī)：Z323K，德國(guó)Hemel 公司；超聲波清洗器：KQ5200DE，昆山超聲波儀器廠；全自動(dòng)凝膠凈化系統(tǒng)：Auto clean，美國(guó)Lab Tech 公司,色譜柱填 料Bi0-Beads S-X3； 氮 吹 儀：N-EVAP， 美 國(guó)Organomation Associates 公司；色譜柱：BCH C18，美國(guó)Waters 公司；微孔濾膜：0.20μm 有機(jī)濾膜。

1.2 試劑

甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品：98.5%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；甲醇、乙腈、環(huán)己烷、石油醚、三氯甲烷：色譜純，美國(guó)Tedia 公司；試驗(yàn)用水：≥18.2 MΩ/cm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、中間液的配制 準(zhǔn)確稱取苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品10.15 mg，加入少量乙腈溶解，轉(zhuǎn)移、定容至100 m L 容量瓶中，該儲(chǔ)備液濃度為100 μg/m L，避光儲(chǔ)存在4℃冰箱中。

準(zhǔn)確吸取1.00 m L 上液于100 m L 容量瓶中，乙腈定容，該中間液濃度為1.00 μg/m L，可短時(shí)間保存。

1.3.2 工作曲線溶液的配制精確吸取一定量的中間液于50 m L 容量瓶中，乙腈定容，配成質(zhì)量濃度為0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0 μg/m L 的標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3.3 液相色譜分析條件 色譜柱：BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈+水(75%+25%)；流速：0.2 m L/min；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)362 nm，發(fā)射波長(zhǎng)407 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.4 樣品提取 準(zhǔn)確稱取樣品5.00 g 于50 m L 具塞離心管中，加入5 m L 乙腈、10 m L 1 mol/L KOH 溶液，于50℃的水浴中皂化1 h，皂化完畢后，冷卻到室溫，再加入10 m L 正己烷，渦旋震蕩提取3 m in，取出水相，然后在有機(jī)相中加入5 g 無(wú)水硫酸鈉充分混勻，液層轉(zhuǎn)入至50 m L 雞心瓶?jī)?nèi)，在45℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮約2 m L 時(shí)取下雞心瓶，待凈化。

1.3.5 GPC 凈化（樣品凈化） 將雞心瓶中的液體轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，使用二氯甲烷定容至10 m L，進(jìn)行GPC 凈化。GPC 定量環(huán)體積為5 m L，流動(dòng)相使用二氯甲烷，柱流速4.5 m L/m in，收集時(shí)間6.8 ～16.0 m in。餾分收集后氮吹濃縮至干，用乙腈溶液定容至1 m L，經(jīng)0.20 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，供超高效液相色譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

目前文獻(xiàn)中用作苯并(a)芘殘留物的提取劑種類繁多,利用其易溶于苯、正已烷等有機(jī)溶劑的特性，以正己烷、甲醇、乙腈為提取劑時(shí)均有一定的提取效率。此外，有研究表明苯具有更為優(yōu)越的提取效率，但考慮到苯的強(qiáng)致癌性質(zhì)，出現(xiàn)的文獻(xiàn)中大都避免采用這種提取溶劑。

對(duì)于煙熏食品，苯并(a)芘不僅殘存于脂肪顆粒中，還能滲透于整個(gè)堅(jiān)實(shí)的肌肉組織中；處理煙熏魚(yú)類高油脂、高物理強(qiáng)度樣品，在采用乙腈作為提取劑，將提取出來(lái)的油脂通過(guò)KOH 進(jìn)行皂化處理,既有效地除去油脂類雜質(zhì)，同時(shí)不會(huì)影響殘留物的提取效率。試驗(yàn)還采用環(huán)己烷、三氯甲烷和石油醚作為提取劑進(jìn)行樣品的處理，通過(guò)計(jì)算回收率比較相應(yīng)的提取效率,相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 不同提取劑的提取效率

2.2 凈化條件的選擇

分別采用其他文獻(xiàn)中利用效率和作用效果最好的Folorisil SPE 小柱[8]和C18 小柱[9]作為凈化手段與本試驗(yàn)方法中所采用的凝膠凈化系統(tǒng)作對(duì)比試驗(yàn)。

弗羅里硅土是高選擇性的吸附劑，在正相條件下能夠從非極性基質(zhì)中強(qiáng)烈吸附極性分析物，對(duì)多環(huán)芳烴類化合物有較強(qiáng)的選擇吸附能力，目前在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多；而C18 小柱是一種更為廣泛使用的萃取小柱，但對(duì)苯并（a）芘殘留物不具備很高的選擇吸附能力和凈化作用；實(shí)驗(yàn)室嘗試使用全自動(dòng)凝膠凈化系統(tǒng)處理提取后的試樣，并對(duì)這三種凈化途徑的樣品作超高效液相色譜進(jìn)樣分析和重現(xiàn)性（n=6）測(cè)定。發(fā)現(xiàn)經(jīng)C18 小柱處理的樣品圖譜基質(zhì)強(qiáng)度相應(yīng)最大，非目標(biāo)組分種類較多（圖1）；而Folorisil 小柱選擇吸附能力與全自動(dòng)凝膠凈化系統(tǒng)的相當(dāng)，樣品的凈化效果稍差（圖2），但平行試樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD=8.86%）明顯高于后者（RSD=3.25%）。故實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)凝膠凈化系統(tǒng)凈化樣品提取液（圖3）。

圖1 全自動(dòng)凝膠凈化系統(tǒng)凈化的樣品圖譜

圖2 Folorisil SPE 小柱凈化的樣品圖譜

圖3 C18 小柱凈化的樣品圖譜

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

食品中苯并（a）芘的熒光測(cè)定方法在檢測(cè)波長(zhǎng)選擇有多種報(bào)道，發(fā)射波長(zhǎng)主要采用400～410 nm，而激發(fā)波長(zhǎng)的選擇區(qū)間較大，在290～380 nm。例如李念念等[10]采用的激發(fā)波長(zhǎng)365 nm、檢測(cè)波長(zhǎng)410 nm，李旭華等[11]采用的激發(fā)波長(zhǎng)296 nm、檢測(cè)波長(zhǎng)404 nm，而SC/T 3041-2008 標(biāo)準(zhǔn)方法[12]采用的激發(fā)波長(zhǎng)297 nm、檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm。

實(shí)驗(yàn)將苯并（a）芘儲(chǔ)備液用乙腈溶液溶解后，分別從樣品中測(cè)定提取其最大激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）和發(fā)射波長(zhǎng)（Em）。發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為407 nm，而激發(fā)波長(zhǎng)出現(xiàn)了兩處，分別為294.6 nm 和362.2 nm，采用Waters FLR 檢測(cè)器的多通道測(cè)定功能，從兩個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)標(biāo)液和樣品采集的分析結(jié)果來(lái)看，362 nm 作為激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)圖譜的基線平穩(wěn)，出現(xiàn)的溶劑峰（非目標(biāo)峰）種類少、相應(yīng)的響應(yīng)度小，所以選用362、407 nm分別作為本試驗(yàn)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，具體提取圖譜如圖4、圖5。

圖4 最大激發(fā)波長(zhǎng)的提取

圖5 最大吸收波長(zhǎng)的提取

2.4 實(shí)驗(yàn)方法評(píng)價(jià)

2.4.1 方法的線性范圍 將配成濃度為0.000 5、0.001 0、0.005 0、0.010 0、0.020 0 μg/m L 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按1.3.3 的色譜條件進(jìn)行UPLC 進(jìn)樣分析，以保留時(shí)間定性，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制工作曲線，結(jié)果表明，線性范圍在0.000 5～0.020 0 μg/m L，其線性回歸方程Y=579 510 X-414 899，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。

2.4.2 檢出限 將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋后添加于空白樣品中，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，以5 倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限為0.5 μg/kg。

2.4.3 回收率和精密度 在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)翹嘴鲌、小黃魚(yú)、麥穗魚(yú)三類樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，苯并(a) 芘的添加水平為1.0～50 μg/kg，每個(gè)水平作6個(gè)平行樣，各添加水平的回收率和精密度如表2。結(jié)果表明，添加濃度1.0～50 μg/kg時(shí), 回收率范圍72.2%～90.4%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍0.96%～8.26%。

表2 不同煙熏魚(yú)苯并（a）芘回收率和精密度

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)市購(gòu)的翹嘴鲌、小黃魚(yú)、麥穗魚(yú)等煙熏魚(yú)進(jìn)行苯并(a)芘含量的分析測(cè)定,發(fā)現(xiàn)一例翹嘴鲌樣品中檢出苯并(a)芘,含量為1.55 μg/kg，其余樣品均未檢出苯并(a)芘。

此外，同時(shí)采用該方法為鮮活的鯉魚(yú)、草魚(yú)、對(duì)蝦等水產(chǎn)品進(jìn)行苯并(a)芘含量的測(cè)定，沒(méi)有出現(xiàn)疑似陽(yáng)性樣品，所采集分析的樣品圖譜基線平穩(wěn)、基質(zhì)峰少、添加回收樣中目標(biāo)組分無(wú)干擾、回收率高，表明該方法同樣適用于鮮活水產(chǎn)品中苯并(a)芘殘留物的測(cè)定。

3 結(jié)論

煙熏食品中基質(zhì)組成頗為復(fù)雜,蛋白質(zhì)種類多樣，油脂含量豐富，熏制后的樣品肌肉組織僵硬，給前處理帶來(lái)直接影響。本實(shí)驗(yàn)采用最新的全自動(dòng)凝膠凈化系統(tǒng)凈化處理技術(shù)進(jìn)行樣品的處理，與目前常用的Florisil 固相萃取柱凈化、C18 小柱凈化的作用效果對(duì)比，具有以下特點(diǎn)：①有效排除了樣品中復(fù)雜的基質(zhì)成分、無(wú)雜峰對(duì)目標(biāo)峰的干擾，得到更為干凈的色譜圖背景，譜圖峰形好。②該方法的回收率高，同時(shí)由于采用自動(dòng)處理程序致使處理好的樣品的平行性好、精密度高。③該方法前處理簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高，給實(shí)驗(yàn)室操作人員帶來(lái)更多的安全保障。實(shí)驗(yàn)證明，該法樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，分離效果好，明顯提高了檢測(cè)效率，且具備準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，為一種較好的測(cè)定煙熏魚(yú)與鮮活水產(chǎn)品中苯并（a）芘殘留物的方法，符合現(xiàn)代檢測(cè)的發(fā)展需求。

此外，煙熏食品中多環(huán)芳烴類化合物在前處理器皿和檢測(cè)設(shè)備中極易殘留，建議所使用的器皿在使用前采用甲醇溶液侵泡處理，檢測(cè)設(shè)備在使用前后需進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的清洗。

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