孔雀石綠（malachite green，MG）又名孔雀綠、堿基綠，為翠綠色有光澤的結(jié)晶，屬三苯甲烷類染料，極易溶于水，水溶液呈藍(lán)綠色。在漁業(yè)生產(chǎn)中，孔雀石綠常被用作驅(qū)蟲劑、殺蟲劑、防腐劑，主要用于預(yù)防與治療水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等。近年來，不斷有研究報道，孔雀石綠會在水產(chǎn)動物體內(nèi)積累，產(chǎn)生高殘留和高毒性，并且可通過食物鏈進(jìn)入人體，具有潛在的致癌風(fēng)險，威脅人類健康。因此，美國、英國、加拿大、日本和我國已明令禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中使用孔雀石綠。2002年5月，我國將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，孔雀石綠的使用得到了有效遏制。然而，由于其具有抗菌、殺蟲、保鮮等功效，加之易于獲得、高效價廉且替代品少，在水產(chǎn)動物的孵化、育苗以及養(yǎng)殖、運輸和銷售等環(huán)節(jié)仍有違規(guī)使用的現(xiàn)象。

目前，關(guān)于孔雀石綠在水產(chǎn)動物方面的研究多集中在藥物富集殘留及消除代謝方面，涉及的水產(chǎn)動物有鯽魚[1]、草魚[2]、歐洲鰻鱺[3]、大菱鲆[4]、羅非魚[5]、青石斑魚[6]、中華絨螯蟹[7]、斑點叉尾鮰[8]以及烏鱧[9]和南美白對蝦[10]等。有關(guān)孔雀石綠在養(yǎng)殖鱖魚方面的研究，尤其是對鱖魚的毒性效應(yīng)研究鮮有報道。筆者從組織學(xué)角度研究了在孔雀石綠浸浴條件下，用藥前后養(yǎng)殖鱖魚的組織病理變化，以期為鱖魚的科學(xué)育苗和養(yǎng)殖以及加強該類藥物的監(jiān)管提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 鱖魚來源 鱖魚購自澧縣柳耳壩魚類苗種繁育場，為人工繁養(yǎng)的翹嘴鱖，其體長為24.6±2.3 cm，體重為352.46±40.25 g。試驗開始前，先暫養(yǎng)3 d，選取體表完好、體質(zhì)健康的個體開始正式試驗。

1.1.2 養(yǎng)殖條件 2014年，養(yǎng)殖試驗在湖南省水產(chǎn)原種場繁育基地水泥池中（規(guī)格3.20 m×1.55 m×0.80 m）進(jìn)行，采用微流水養(yǎng)殖，保持水質(zhì)清新，水體溶氧充足，日換水量約為40%。試驗期間，水體pH 值為6.42～6.86，水溫為12～15℃，水體透明度為40～50 cm，葉綠素a 含量為0.17～0.24 mg/L，溶解氧含量介于5.57～6.74 mg/L。餌料魚為人工繁殖的四大家魚，由湖南省水產(chǎn)原種場提供，體長為4.5±1.2 cm，餌料魚與鱖魚的投放比例約為10︰1。

1.2 試驗設(shè)計

孔雀石綠藥浴試驗在直徑為1 m 的圓形塑料桶中進(jìn)行，藥浴完畢后轉(zhuǎn)入水泥池中微流水飼養(yǎng)，分別設(shè)試驗組和對照組。在水溫為10±0.5℃，不間斷充氧條件下，以5 mg/L 的孔雀石綠溶液浸泡鱖魚120 m in，再將其轉(zhuǎn)入水泥池中微流水飼養(yǎng)，分別在藥浴30、60、90 和120 m in 時以及停藥后第0.5、1、2、4、8、12、16、20、25 和30 d 采樣；對照組除不藥浴孔雀石綠溶液外，其他處理與試驗組相同。每次隨機采集3～5尾鱖魚，其中部分用于孔雀石綠藥物殘留代謝檢測，部分個體分別取其血液、皮膚、鰓、背肌、腹肌、肝臟、腎臟、脾臟及腸道用于組織切片觀察。鱖魚血液直接用玻璃片涂片吉姆薩染色后顯微觀察血液的細(xì)胞形態(tài)變化，其他組織用10%甲醛水溶液固定，采取HE染色法染色后顯微觀察用藥前后鱖魚不同機體組織的病理變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 孔雀石綠用藥前后鱖魚血液中血細(xì)胞變化

用5 mg/L 的孔雀石綠溶液對鱖魚進(jìn)行藥浴，并分別在藥浴30、60、90 和120 m in 時以及停藥后第0.5、1、2、4、8、12、16、20、25 和30 d 分別采樣鱖魚血液制成血涂片吉姆莎染色觀察。結(jié)果表明，孔雀石綠藥浴前后，鱖魚的血液細(xì)胞在形態(tài)上與對照組鱖魚并無顯著差異，只是紅細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)量及密度水平上有所不同，見圖1。

圖1 孔雀石綠藥浴前后鱖魚的血液細(xì)胞形態(tài)

2.2 孔雀石綠用藥前后鱖魚皮膚、肌肉及鰓組織的變化

試驗條件下，鱖魚皮膚的組織切片結(jié)果表明，藥浴期間，隨著用藥時間的延長，鱖魚體表粘液增加，鱖魚皮膚對孔雀石綠的應(yīng)激反應(yīng)逐漸加重，在組織病理學(xué)方面主要表現(xiàn)為上表皮層炎癥細(xì)胞增多，停藥轉(zhuǎn)微流水養(yǎng)殖后，鱖魚皮膚組織的炎癥細(xì)胞逐漸減少，從第1～2 天開始基本與對照組鱖魚一樣，如圖2 所示。

鱖魚肌肉的組織切片結(jié)果表明，藥浴期間及停藥微流水養(yǎng)殖后，鱖魚的背肌及腹肌組織與對照組鱖魚基本一樣，并無明顯病理變化，如圖3～圖4 所示。

鱖魚鰓的組織切片結(jié)果表明，隨著藥浴時間的加長，鱖魚鰓絲充血加重，并出現(xiàn)腫脹癥狀，轉(zhuǎn)入微流水后逐漸好轉(zhuǎn)，與對照組無明顯差異，鰓絲排列整齊，具有自然張力，鰓小片有規(guī)則地呈羽狀互生排列，如圖5所示。

2.3 孔雀石綠用藥前后鱖魚內(nèi)臟組織的變化

鱖魚肝臟的組織切片結(jié)果表明，藥浴期間，隨著時間的延長，鱖魚肝臟充血，出現(xiàn)輕微腫脹，肝細(xì)胞間隙增大，排列紊亂，部分肝細(xì)胞空泡化、細(xì)胞質(zhì)分布不均勻以及細(xì)胞核異位、固縮；轉(zhuǎn)入微流水培養(yǎng)4～8 d 后癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，與對照組無明顯差異，如圖6 所示。

鱖魚腎臟的組織切片結(jié)果表明，藥浴期間，隨著時間的延長，鱖魚腎臟充血，出現(xiàn)輕微水腫癥狀；轉(zhuǎn)入微流水培養(yǎng)1～2 d 后逐漸恢復(fù)正常，與對照組并無明顯差異，如圖7 所示。

圖2 藥浴前后鱖魚皮膚組織切片

圖3 藥浴前后鱖魚背肌組織切片

圖4 藥浴前后鱖魚腹肌組織切片

圖5 藥浴前后鱖魚腮組織切片

圖6 藥浴前后鱖魚肝組織切片

圖7 藥浴前后鱖魚腎臟組織切片

鱖魚脾臟組織切片結(jié)果表明，藥浴期間，隨著時間的延長，鱖魚脾臟充血，出現(xiàn)輕微水腫癥狀；轉(zhuǎn)入微流水培養(yǎng)1～2 d 后逐漸恢復(fù)正常，只是細(xì)胞排列緊密程度有所不同，與對照組無明顯差異，如圖8 所示。

鱖魚腸道組織切片結(jié)果表明，藥浴期間及停藥后，鱖魚腸道只是杯狀細(xì)胞數(shù)量上與對照組有所不同，其他方面并無明顯差異，如圖9 所示。

圖8 藥浴前后鱖魚脾臟組織切片

圖9 藥浴前后鱖魚腸道組織切片

3 討論

3.1 孔雀石綠用藥前后鱖魚的血細(xì)胞變化

研究表明，孔雀石綠及其代謝物對水產(chǎn)動物的毒性不僅與暴露時間、用藥濃度和水溫條件正相關(guān)，而且與水質(zhì)環(huán)境，尤其是水體pH 值、硬度和溶解氧的高低密切相關(guān)[11]。魚類外周血細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化是機體在環(huán)境脅迫下敏感的特征性指標(biāo)，紅細(xì)胞微核率更是反映了其對外界應(yīng)激反應(yīng)的敏感程度。正常鱖魚成熟的紅細(xì)胞多呈橢圓形，表面光滑，核呈橢圓形或圓形，多位于細(xì)胞中央，吉姆莎染色后細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈較淺的紅色（圖1C）。周立紅等[12]研究了鳙魚和尼羅羅非魚分別在0.02～0.50 mg/L 和0.2～1.0 mg/L 的孔雀石綠溶液中暴露7 d 后其紅細(xì)胞微核率的變化特征，結(jié)果表明，鳙魚對孔雀石綠比尼羅羅非魚敏感，其紅細(xì)胞微核率隨者用藥濃度的升高而增加。該研究結(jié)果表明，孔雀石綠藥浴期間鱖魚的紅細(xì)胞在形態(tài)上與停藥后期、對照組均沒有明顯差異，只是紅細(xì)胞數(shù)量水平及密度較高，這可能與水體中缺氧，鱖魚血液中紅細(xì)胞的攜氧運動有關(guān)。同時，試驗組紅細(xì)胞微核率與對照組并無明顯差異，這與周立紅等[12]人的研究結(jié)果有所不同，可能與試驗對象、個體大小、藥浴時間和濃度以及水質(zhì)環(huán)境條件等有關(guān)。

3.2 孔雀石綠用藥前后鱖魚的皮膚、鰓以及肌肉組織變化

魚類的皮膚是抵御外界環(huán)境的第一道屏障。試驗條件下，藥浴期間鱖魚對孔雀石綠的應(yīng)激反應(yīng)較強，主要表現(xiàn)為鱖魚體表粘液增加，皮膚上表皮炎癥細(xì)胞增多，停藥微流水養(yǎng)殖后，上述癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，這表明鱖魚的皮膚組織具有自我調(diào)節(jié)功能。

魚類的鰓不僅是氣體交換、鹽水交換的主要場所，同時也是代謝廢物排泄的主要器官之一。Gerundo等[13]研究了虹鱒魚在0.14 mg/L 孔雀石綠溶液中暴露30～60 d 后的組織病理變化，結(jié)果表明，虹鱒魚在孔雀石綠中長時間暴露，可導(dǎo)致虹鱒魚的鰓嚴(yán)重受損，鰓上皮細(xì)胞和片層細(xì)胞壞死，白細(xì)胞浸潤。而該試驗條件下，隨著藥浴時間的延長，鱖魚鰓絲充血加重，出現(xiàn)腫脹，轉(zhuǎn)入微流水后逐漸好轉(zhuǎn)，并無其他病理變化，這與Gerundo 等人的研究結(jié)果有所不同，表明短時間藥浴并不會對鱖魚的鰓組織造成明顯損害，其鰓絲與對照組一樣，排列整齊，具有自然張力，鰓小片有規(guī)則地呈羽狀互生排列。此外，藥浴前后鱖魚肌肉組織與對照組并無明顯病理變化，表明用孔雀石綠短時間高濃度的藥浴并不會對鱖魚的肌肉組織造成損傷，這可能與孔雀石綠及其代謝物在肌肉組織的殘留水平有關(guān)。

3.2 孔雀石綠用藥前后鱖魚的內(nèi)臟組織變化

研究表明，孔雀石綠進(jìn)入動物體內(nèi)后，可以通過生物轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)化成脂溶性代謝產(chǎn)物——無色孔雀石綠[14]，其殘留毒性比孔雀石綠更強，而且主要蓄積在血清、肝、腎、肌肉、皮膚及其他內(nèi)臟中[15-16]。該試驗條件下，孔雀石綠對鱖魚內(nèi)臟組織影響較大的是肝臟組織，可導(dǎo)致鱖魚肝臟充血，出現(xiàn)輕微腫脹癥狀，肝細(xì)胞細(xì)胞間隙增大，排列紊亂，部分肝細(xì)胞空泡化、細(xì)胞質(zhì)分布不均勻以及細(xì)胞核異位、固縮，這表明肝臟組織是孔雀石綠及其代謝物的主要靶器官，與Gerundo等對虹鱒魚的研究有所不同，鱖魚的肝臟細(xì)胞并未出現(xiàn)壞死和肝硬化，這可能與孔雀石綠的藥浴時間、藥浴濃度、魚體種類以及環(huán)境條件等有關(guān)。同時，試驗鱖魚經(jīng)微流水飼養(yǎng)4～8 d 后肝臟組織癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，與對照組并無明顯差異，這表明孔雀石綠對鱖魚肝臟造成的損傷是可逆的和可修復(fù)的。此外，對鱖魚腎臟、脾臟以及腸道組織的研究顯示，孔雀石綠短時間的藥浴會對鱖魚的腎臟和脾臟造成水腫及充血，影響腸道組織杯狀細(xì)胞的數(shù)量，與Gerundo 等對虹鱒魚的研究也有所不同，這也可能與試驗對象、藥浴時間及環(huán)境條件等有關(guān)。

浸浴條件下，孔雀石綠對鱖魚的毒性大小與鱖魚的個體大小、藥浴濃度、藥浴時間以及水質(zhì)條件和天氣狀況等因素有關(guān)，其對鱖魚的毒性效應(yīng)是外部環(huán)境與鱖魚組織機能綜合作用的結(jié)果，有關(guān)孔雀石綠用藥前后鱖魚的血液組成及組織中酶活性變化以及毒性效應(yīng)的形成機理還有待進(jìn)一步深入研究。

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