鄢一笑，劉前剛，楊習(xí)群，陳海榮，杜 宇，靳 磊，魏小武，張德元

（湖南省微生物研究院， 湖南 長(zhǎng)沙410009）

近年來(lái)，湖南省水稻稻曲病發(fā)生呈逐年加重的趨勢(shì)，流行性強(qiáng)，危害嚴(yán)重，不僅造成大量癟粒病粒，導(dǎo)致稻谷產(chǎn)量及品質(zhì)下降，而且病粒含有毒素，這種毒素能引起人畜慢性中毒，極大的影響了糧食高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和食品安全[1]。目前，還未發(fā)現(xiàn)水稻稻曲病高抗品種，生產(chǎn)上主要依賴愛苗、萬(wàn)興、好力克等化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治[2]。尤其是某些農(nóng)藥的毒性大、殘留高，對(duì)生態(tài)平衡和人們的健康產(chǎn)生了較大影響，成為當(dāng)前防治水稻稻曲病亟待解決的問(wèn)題[3]。試驗(yàn)從易于定殖到水稻葉部的葉際微生物著手，以期篩選出水稻稻曲病的高效防治菌株，更好地發(fā)揮生防微生物的防病潛能，為最終培育出對(duì)人畜安全的優(yōu)質(zhì)水稻品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

稻曲病病原菌從湖南長(zhǎng)沙市郊稻田稻曲病發(fā)病植株病穗中采集提取?？估Ｆ?00 μg/m L 和抗病原真菌雙標(biāo)記突變菌株——F26 菌株和F26-T 菌株，由湖南省微生物研究院植保微生物室分離及選育。供試水稻品種為華優(yōu)451，由湖南湘東種業(yè)有限公司提供。供試培養(yǎng)基有：（1）PSA 培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 m L；（2）PS 培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、蒸餾水1 000 m L；（3）改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基（F26 菌株活化培養(yǎng)用），可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、NaCl 0.5 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 m L；（4）選擇抗性培養(yǎng)基（F26-T 菌株選擇性培養(yǎng)用），在改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入利福平溶液，使其在培養(yǎng)基中濃度為200 μg/m L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 F26-T 菌株對(duì)水稻稻曲病菌的拮抗作用 參照程明淵等[4]的試驗(yàn)方法，將水稻稻曲病菌（橘黃色稻曲球）接種到PS 培養(yǎng)液中，5～8 d 鏡檢，待產(chǎn)生分生孢子后，將分生孢子液和冷卻至45℃的PSA 混合后倒平板，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d 后，再將供試拮抗菌株點(diǎn)接到平板，每個(gè)平板對(duì)稱點(diǎn)接兩個(gè)菌株，然后置26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d 后觀察并記錄結(jié)果，以平均抑菌帶寬、抑菌圈平均直徑/拮抗菌落平均直徑之比來(lái)衡量生防菌的拮抗效果。

1.2.2 F26-T 菌株發(fā)酵濾液對(duì)稻曲病菌的抗生作用將供試拮抗菌株活化后轉(zhuǎn)接到高氏改良一號(hào)培養(yǎng)液中，置28℃，180 r/min 搖床震蕩發(fā)酵6 d，發(fā)酵液經(jīng)滅菌濾紙過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 m L 離心管，4℃、8 000 r/min 離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾后備用。將稻曲病菌接種到PS 培養(yǎng)液中，待產(chǎn)生分生孢子后，將分生孢子液和冷卻至45℃的PSA 混合倒平板，待平板冷卻后，置一無(wú)菌牛津杯（內(nèi)徑0.7 cm，高0.9 cm）于平板中心，將300 μL 的F26-T 菌株發(fā)酵濾液原液、F26-T 菌株發(fā)酵濾液稀釋5 倍液和F26-T 菌株發(fā)酵濾液稀釋10 倍液分別加入到不同的牛津杯中，以5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液和無(wú)菌水為對(duì)照，置26℃恒溫箱中培養(yǎng)，5 d 后觀察并記錄各處理的抑菌圈直徑。

1.2.3 F26-T 菌株孢子懸液對(duì)水稻稻曲病的田間防效 將培養(yǎng)好的放線菌F26 用無(wú)菌水稀釋制成1.0×106cfu/m L 的孢子懸液，于水稻有穗分化期分3 次連續(xù)3 d 噴霧接種孢子懸液，以孢子懸液在水稻葉片上不下滴為宜，以5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液和無(wú)菌水為正負(fù)對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)小區(qū)8 m2（2 m×4 m），各小區(qū)間隔不小于2 m，隨機(jī)排列。待水稻黃熟期，采用五點(diǎn)取樣法，每個(gè)重復(fù)調(diào)查25 叢水稻，調(diào)查指標(biāo)有總稻穗數(shù)和病稻穗數(shù)，并以病穗數(shù)為單位，采用5 級(jí)分級(jí)法，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果[5]。水稻稻曲病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下：0 級(jí)：無(wú)??；1 級(jí)：每穗有1個(gè)病粒；2 級(jí)：每穗有2～4個(gè)病粒；3 級(jí)：每穗有5～7個(gè)病粒；4 級(jí)：每穗有8～10個(gè)病粒；5 級(jí)：每穗有10個(gè)病粒以上。

1.2.4 F26-T 菌株在水稻葉圍的定殖情況 水稻種子用1%次氯酸鈉浸種消毒5 m in，用無(wú)菌水漂洗3 次，然后播種，采取常規(guī)措施對(duì)水稻進(jìn)行施肥澆灌等田間管理。將培養(yǎng)好的放線菌F26 用無(wú)菌水稀釋制成1.0×106cfu/m L 的孢子懸液，于水稻有穗分化期分3 次連續(xù)3 d 噴霧，以孢子懸液在水稻葉片上不下滴為宜。分別于第3 次噴霧接種后0、1、3、6、9、12 和15 d 采集水稻葉片，取樣時(shí)兼顧水稻植株上、中和下部葉片。利用抗性選擇培養(yǎng)基采用梯度稀釋法檢測(cè)F26-T 菌株在水稻稻葉中的數(shù)量，計(jì)算單位重量水稻葉片中F26-T菌株的定殖量。

2 結(jié)果與分析

2.1 F26-T 菌株對(duì)水稻稻曲病菌的拮抗作用

試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)PSA 平板對(duì)峙培養(yǎng)5 d 后，F(xiàn)26-T 菌株對(duì)水稻稻曲病菌的平均抑菌帶寬為14.5 mm，其抑菌圈平均直徑與拮抗菌落平均直徑之比為5.05；而初始菌株F26 對(duì)水稻稻曲病菌的平均抑菌帶寬為14.7 mm，其抑菌圈平均直徑與拮抗菌落平均直徑之比為5.12。兩菌株的差異不明顯，表明F26-T 突變菌株和初始菌株F26 對(duì)水稻稻曲病菌具有相同的拮抗作用。

2.2 F26-T 菌株發(fā)酵濾液對(duì)稻曲病菌的抗生作用

試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)26-T 發(fā)酵濾液原液的平均抑菌圈直徑為25.2 mm，明顯優(yōu)于5%井岡霉素水劑500倍稀釋液稀釋處理的平均抑菌圈直徑（20.1 mm）；F26-T 發(fā)酵濾液5 倍稀釋液的平均抑菌圈直徑為20.5 mm，與5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液稀釋處理的平均抑菌圈直徑相當(dāng)；稀釋10 倍的F26-T 發(fā)酵濾液平均抑菌圈直徑為17.2 mm，稍差于5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液稀釋處理；而無(wú)菌水對(duì)照處理的平均抑菌圈直徑為0 mm。

2.3 F26-T 菌株孢子懸液對(duì)水稻稻曲病的田間防效

從表1 中可以看出，無(wú)菌水處理的稻曲病病情指數(shù)極顯著高于其他處理；孢子懸液原液、孢子懸液5倍稀釋液和孢子懸液10 倍稀釋液對(duì)水稻稻曲病的田間相對(duì)防效分別為76.93%、66.23%和53.96%；其中，F(xiàn)26-T 菌株孢子懸液原液對(duì)水稻稻曲病的田間防效極顯著高于5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液處理；而F26-T 菌株孢子懸液5 倍稀釋液和10 倍稀釋液對(duì)水稻稻曲病的田間防效與5%井岡霉素水劑500 倍稀釋液處理無(wú)顯著性差異。

表1 F26-T 菌株孢子懸液對(duì)水稻稻曲病的田間防效

2.4 F26-T 菌株在水稻葉圍的定殖情況

由圖1 可知，接種后第0～1 天，F(xiàn)26-T 菌落數(shù)下降較為明顯；第1～6 天，菌落數(shù)逐漸增加，并上升至最高；第6～15 天，菌落數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定；以接種后第6天的菌落數(shù)最多，為8.54×103cfu/m L。因此，F(xiàn)26-T 菌株在水稻葉圍定殖情況為：接種后第1 天該菌株數(shù)量下降明顯，第3～6 天該菌株逐漸適應(yīng)，并進(jìn)入生長(zhǎng)繁殖期，第9～15 天該菌株在水稻葉圍的數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定。

圖1 F26-T 菌株在水稻葉圍的定殖情況

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，F(xiàn)26-T 菌株對(duì)水稻稻曲病病原菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗和抗生作用。該菌株在水稻葉圍噴霧接種后第3～6 天就已逐漸適應(yīng)葉圍環(huán)境，進(jìn)入定殖生長(zhǎng)階段，這是其對(duì)水稻稻曲病有生防作用的主要原因之一；其孢子懸液原液、5 倍稀釋液和10 倍稀釋液的田間相對(duì)防效分別為76.93%、66.23%和53.96%，效果較為理想。該研究為水稻稻曲病的防治提供了一條新的途徑，但該菌株的生防機(jī)制以及在其定殖點(diǎn)菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)素的適宜條件等還需進(jìn)一步探索。

趙新華等[6]和Nair 等[7]分別從水稻和咖啡葉圍成功篩選出芽孢桿菌菌株，這些菌株對(duì)水稻白葉枯病菌及多種植物病原真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)拮抗作用。自然界中，水稻（寄主）、病原物（稻曲病病菌）、生防微生物和環(huán)境之間的關(guān)系是極為復(fù)雜的，需明確水稻葉部、穗部生防微生物與病原物及其他生物、分泌物和各種環(huán)境因子之間的相互作用及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，才能有效地調(diào)控?zé)o機(jī)與有機(jī)環(huán)境，為生防微生物創(chuàng)造適宜環(huán)境，改進(jìn)其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，以更好地發(fā)揮生防微生物的防病促生等功能。

[1]鄒克琴，胡東維，王為民，等.水稻稻曲病的研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，（5）：704-706.

[2]張 舒，張求東，羅漢剛，等.水稻稻曲病的藥效試驗(yàn)和防治適期的選定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（2）：178-181.

[3]尹小樂(lè)，陳志誼，劉永鋒，等.稻曲病拮抗細(xì)菌的篩選與評(píng)價(jià)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，27（5）：983-989.

[4]程明淵，劉洪濤，閻萬(wàn)元，等.人工培養(yǎng)條件下稻曲病菌厚垣孢子產(chǎn)生因素初探[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，（2）：62-64．

[5]何明遠(yuǎn)，張戰(zhàn)泓，劉建宇，等.27.12%堿式硫酸銅懸浮劑（銅高尚）防治水稻稻曲病田間藥效試驗(yàn)[J].新農(nóng)藥，2006，10（1）：26-27.

[6]趙新華，陳衛(wèi)良，李德葆，等.白葉枯病菌拮抗菌篩選及水稻葉圍微生物互作研究初報(bào)[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2000，14（3）：161-164.

[7]Nair JR，Singh G，Sekar V.Isolation and characterization of a novel Bacillus strain from coffee phyllosphere showing antifungal activity[J].JouralofAppiled Microbiology，2002，93（5）：772-880.