施文驍，顧雪迎，郭慶元*，王洪凱*

（1.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增快速檢測(cè)葡萄根癌病菌技術(shù)體系的建立

施文驍1，顧雪迎2，郭慶元2*，王洪凱1*

（1.浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310058；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

葡萄根癌病是葡萄上的重要病害之一。設(shè)計(jì)適用于葡萄根癌病菌環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增的特異性引物，并建立快速檢測(cè)葡萄根癌病菌的環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增檢測(cè)體系。

葡萄根癌病；環(huán)介導(dǎo)同溫?cái)U(kuò)增；快速檢測(cè)

文獻(xiàn)著錄格式：施文驍，顧雪迎，郭慶元，等.環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增快速檢測(cè)葡萄根癌病菌技術(shù)體系的建立 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（12）：2015-2018.

葡萄根癌病是世界范圍內(nèi)葡萄種植區(qū)的一種嚴(yán)重病害，為害葡萄后，在葡萄的根莖部位形成粗大的癌腫是其典型的癥狀［1-2］。關(guān)于引起葡萄根癌病的病原，目前全世界報(bào)道有2種，Agrobacterium vitis和A.rhizogenes。來自分子和脂肪酸的研究表明，A.vitis和A.rhizogenes的親緣關(guān)系很近［3］。但大量試驗(yàn)確認(rèn)，葡萄根癌病的主要病原菌是A. vitis［1］。在我國(guó)，葡萄根癌病菌是A.vitis，此種細(xì)菌主要生活在根冠及周圍的土壤中，可以在葡萄藤上存活并繁殖，能引起葡萄產(chǎn)量的下降甚至整株葡萄的枯死［1-2］。

快速準(zhǔn)確檢測(cè)是植物病害有效防治的基礎(chǔ)。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到植物病原菌的檢測(cè)中［1］。葡萄根癌病是土傳病害，因而對(duì)苗木、植株進(jìn)行早期檢測(cè)，從源頭上減少帶菌植物，是防治此病害的最直接的方法。目前，基于PCR方法的快速檢測(cè)體系［4-5］，如特異性引物PCR檢測(cè)、熒光定量PCR檢測(cè)體系，已經(jīng)相繼建立［6-8］。但這些方法一般需要比較昂貴的儀器設(shè)備，往往還需要電泳等輔助方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力［9］。環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增方法技術(shù)簡(jiǎn)單，擴(kuò)增過程溫度一致，不需要變溫，時(shí)間短，特異性高，容易成為普及的快速檢測(cè)方法［10-11］。本研究利用從新疆吐魯番地區(qū)分離到的Agrobacterium vitis菌株，建立了環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增快速檢測(cè)葡萄根癌病菌的技術(shù)體系。

1　材料與方法

1.1供試菌株

葡萄根癌病致病菌株A-1，A-2，A-3，A-4（由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，郭慶元教授提供），及標(biāo)準(zhǔn)菌株AV1.2555（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供）。發(fā)根農(nóng)桿菌菌株AGL1由浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所真菌研究室保藏，作為對(duì)照。

1.2葡萄根癌病菌的分子鑒定

根據(jù)國(guó)際上對(duì)葡萄根癌病的研究結(jié)果，獲得用于檢測(cè)葡萄根癌病的7對(duì)引物，引物序列見表1。

表1　用于PCR檢測(cè)的特異性引物

菌體培養(yǎng)、DNA的提取方法按照文獻(xiàn) ［7］的方法進(jìn)行。PCR程序根據(jù)引物的不同，采用文獻(xiàn)中介紹的程序進(jìn)行。

1.3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

1.3.1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物設(shè)計(jì)

在 LAMP引物設(shè)計(jì)的網(wǎng)站 （http：// primerexplorer.jp/e/）上，將目的DNA片段序列按照提示上傳，設(shè)計(jì)引物，選取在特異性序列位置的LAMP引物作為合適的引物序列。

1.3.2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的體系建立

為了建立對(duì)葡萄根癌病最好的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系，在LAMP的一般檢測(cè)體系的基礎(chǔ)上分別對(duì)其引物濃度，Mg2+濃度，Bst酶量，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。具體試驗(yàn)如下：引物FIP/ BIP/F3/B3的加入量設(shè)為3/3/0.25/0.25，2.5/ 2.5/0.25/0.25，2/2/0.25/0.25，3/3/0.5/0.5（單位為μL），4個(gè)梯度；2.5 mmol.L-1Mg2+的加入量為4，5，6和 7μL；Bst酶加入量分別為1.2，1.0，0.8，0.6和0.5 U；將反應(yīng)中加入的DNA濃度分別稀釋至10-1，10-2，10-3，10-4倍；反應(yīng)溫度設(shè)置為55，58，60，63，65℃；反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為30，45，60，90，120 min。通過上述6次試驗(yàn)來確定適用于葡萄根癌病菌的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系。

1.4田間樣品的快速檢測(cè)

將田間的病瘤組織切取3 mm×3 mm×3 mm的小塊，置入200μL無(wú)菌水中，浸泡10 min。然后去掉組織塊，將病菌浸出液在95℃加熱5 min，取2μL為模板，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)同溫?cái)U(kuò)增。以健康的葡萄組織為對(duì)照。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄根癌病菌的特異性DNA片段篩選

葡萄根癌病菌不同菌株之間存在遺傳分化。根據(jù)以前的研究，根據(jù)不同的DNA片段，已經(jīng)有7對(duì)特異性引物用于不同時(shí)間和地點(diǎn)的葡萄根癌病菌的分子鑒定。為了明確哪個(gè)DNA片段適合我們采集到的菌株的檢測(cè)，我們分別以病原菌株A-1，A-2，A-3，A-4，及標(biāo)準(zhǔn)菌株AV1.2555的DNA為模板，用查閱到的7對(duì)PCR引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。其結(jié)果如圖1所示。僅VirFF1/VirFR2能夠擴(kuò)增出單一清晰的條帶，AVSP3-1F/AVSP3-1R和AVSNP-3F/AVSNP-3R均未能擴(kuò)增出條帶，PGF/PGR，NOPFa/NOPRa，Ab3-F3/Ab3-R4和VCF3/VCR3有部分不能擴(kuò)增出條帶，能擴(kuò)出的條帶也不清晰或單一。

圖1　葡萄根癌病病原菌鑒定引物篩選的結(jié)果

引物對(duì)VirFF1/VirFR2對(duì)應(yīng)的DNA片段是Agrobacterium vitis VirF（virF）gene（GenBank No. AF044200）。

2.1.1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

登錄 LAMP引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站 （http：// primerexplorer.jp/e/），導(dǎo)入目的DNA片段序列，自動(dòng)生成引物組。挑選引物正好在病原菌的特異性序列處的引物組 （表2、圖2）。

表2　LAMP特異性引物的序列

圖2　LAMP引物擴(kuò)增序列及6個(gè)特異性區(qū)域

在LAMP檢測(cè)體系中，引物濃度是其主要的影響因素之一，外引物濃度過高會(huì)抑制內(nèi)引物結(jié)合到模板上的起始擴(kuò)增速率，而濃度過低則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不完全。Mg2+是酶開始反應(yīng)的啟動(dòng)因子，影響LAMP整個(gè)反應(yīng)過程的效率。Bst DNA聚合酶是一種具有自主鏈置換活性的DNA聚合酶，該酶是使LAMP反應(yīng)能夠在恒溫條件下進(jìn)行的關(guān)鍵之一，而該酶的活性又直接決定反應(yīng)的效率。Bst DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度為60～65℃，因此LAMP的反應(yīng)溫度應(yīng)設(shè)置在此區(qū)間內(nèi)。

因此在本研究中對(duì)LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄根癌病LAMP反應(yīng)的最佳體系為內(nèi)外引物比10∶1，即FIP/BIP/F3/B3為2.5/2.5/ 0.25/0.25，其余條件皆與文獻(xiàn)提供一致。電泳結(jié)果如圖3所示。

圖3　LAMP最佳反應(yīng)體系的電泳圖

LAMP利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下能夠特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA，能夠在極低的目的片段拷貝數(shù)下發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。為了檢測(cè)LAMP技術(shù)的靈敏度，本研究將病原菌DNA按10的倍數(shù)稀釋5個(gè)梯度進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果顯示，LAMP體系的檢測(cè)靈敏度可達(dá)20 pg。

因此，我們建立的LAMP檢測(cè)體系為 （25μL）：10×Bst緩沖液2.5μL，Mg2+（2.5 mmol.L-1）6μL，F(xiàn)3/B3（20μmol.L-1）各0.25μL，F(xiàn)IP/ BIP（20μmol.L-1）各3μL，dNTP（10 mmol. L-1）3.5μL，ddH2O 4.5μL，1 U.μL-1Bst DNA聚合酶1μL，DNA 1μL。62℃反應(yīng)1 h。

2.1.2田間樣品的快速檢測(cè)

將田間樣品進(jìn)行LAMP反應(yīng)，通過電泳觀察，在病組織樣品中檢測(cè)到病菌，而在健康組織中，沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物，得到如下結(jié)果 （圖4）。

將擴(kuò)增以后的離心管進(jìn)行10 000 r.min-1離心，可觀察到離心管底部有白色沉淀產(chǎn)生。取5μL LAMP反應(yīng)液，加入45μL的稀釋10倍SYBR?GREENⅠ熒光染液，可以觀察到陽(yáng)性反應(yīng)液變成綠色，而陰性反應(yīng)液只起到稀釋熒光染液的作用 （圖5）。

圖4　LAMP田間樣品檢測(cè)的電泳圖

圖5　LAMP田間樣品熒光染色圖

3　小結(jié)與討論

葡萄根癌病是威脅葡萄安全生產(chǎn)的嚴(yán)重病害［2］，建立快速高效的檢測(cè)體系有利于對(duì)該病害的有效防控。

葡萄根癌病菌還可以侵染其他植物，如長(zhǎng)壽花、向日葵、番茄、曼陀羅、煙草、灰藜等，但不同菌株的寄主范圍有差別，對(duì)檢測(cè)引物的反應(yīng)也有不同，說明種內(nèi)存在明顯的遺傳分化［12］。因此，需建立適合于葡萄栽培地的病菌菌株檢測(cè)體系。本研究根據(jù)田間采集到的菌株，建立了適合當(dāng)?shù)鼐甑牡葴丨h(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增的方法，該方法體系不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，只要一個(gè)62℃的保溫器皿及一個(gè)簡(jiǎn)單的紫外燈，即可在60～90 min內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)過程。目前LAMP技術(shù)檢測(cè)葡萄根癌病的體系雖然已經(jīng)建立，但是田間試驗(yàn)還相對(duì)偏少，今后應(yīng)結(jié)合實(shí)際應(yīng)用進(jìn)一步優(yōu)化，從而使其能更有效、更可靠地運(yùn)用于實(shí)際檢測(cè)中。

［1］ 施文驍，王洪凱，郭慶元.葡萄根癌病研究進(jìn)展 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（11）：1418-1421.

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（責(zé)任編輯：張 韻）

S 436.631

A

0528-9017（2015）12-2015-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20151231

2015-07-01

新疆維吾爾自治區(qū)重大項(xiàng)目 （201130102）

施文驍（1990-），女，浙江杭州人，碩士研究生。E-mail：Zjwxshi@gmail.com。

郭慶元。E-mail：guoqingyuan3009@sina.com；王洪凱。E-mail：hkwang@zju.edu.cn。