張望舒，吳夢依，黃瑜秋，周愛存，李明焱

（1.寧波浩豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江 寧波 315033；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 311300；3.浙江省珍稀植物藥工程技術(shù)研究中心，浙江武義 321200）

艾葉和蒼術(shù)熏蒸對金線蓮組培室的空氣滅菌效果

張望舒1，吳夢依1，黃瑜秋2，周愛存2，李明焱3

（1.寧波浩豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，浙江 寧波 315033；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 311300；3.浙江省珍稀植物藥工程技術(shù)研究中心，浙江武義 321200）

分析艾葉、蒼術(shù)單獨熏蒸對金線蓮組培室空氣細(xì)菌和霉菌滅菌效果，獲取艾葉和蒼術(shù)優(yōu)化的用量，同時比較艾葉和蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸法、甲醛高錳酸鉀熏蒸法、過氧乙酸熏蒸法的滅菌效果。結(jié)果顯示，艾葉用量為2.0 g.m-3時的滅菌率為59.4%～69.0%，蒼術(shù)用量為1.5 g.m-3時的滅菌率為51.4%～59.3%；艾葉對霉菌的滅殺效果比對細(xì)菌好，而蒼術(shù)對細(xì)菌的滅殺效果則優(yōu)于對霉菌的效果。艾葉用量2.0 g.m-3和蒼術(shù)用量1.5 g.m-3聯(lián)合熏蒸法滅菌率達(dá)到65.4%；甲醛高錳酸鉀熏蒸法滅菌率為71.5%；過氧乙酸熏蒸法滅菌率為67.0%。連續(xù)3年采用艾葉和蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸，金線蓮組培苗的污染率降低。結(jié)果表明，艾葉與蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸法可應(yīng)用于金線蓮組培室空氣滅菌。

艾葉；蒼術(shù)；金線蓮組培室；熏蒸；滅菌

文獻(xiàn)著錄格式：張望舒，吳夢依，黃瑜秋，等.艾葉和蒼術(shù)熏蒸對金線蓮組培室的空氣滅菌效果 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（12）：1999-2001.

金線蓮（Anoectochilus roxburghii）又名金絲草，為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有清熱涼血、除濕解毒等功效，用于治療糖尿病、腎炎、膀胱炎等癥，在民間享有“藥王”的美稱［1-3］。金線蓮長期以來依靠采挖收集野生資源，而野生金線蓮繁殖率極低，致使資源蘊藏量迅速下降，部分傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)已無藥可采。金線蓮種苗是其栽培的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，種苗的優(yōu)劣直接關(guān)系到金線蓮的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)［4-5］。由于金線蓮種子不具胚乳，只有在真菌共生下，才能促使其種子萌發(fā)生長，所以生產(chǎn)上主要采用莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)。但在組培生產(chǎn)過程中，由細(xì)菌、真菌等微生物引起的污染問題一直是當(dāng)前制約金線蓮種苗繁育的主要障礙［6-7］。

金線蓮組培苗的污染與組培室培養(yǎng)環(huán)境的潔凈度直接相關(guān)，而組培室往往是密閉的，空間潔凈度差，空氣流通少、濕度大，易導(dǎo)致各種細(xì)菌、真菌等微生物滋生。針對組培室的空氣滅菌，傳統(tǒng)的方法是使用甲醛高錳酸鉀熏蒸、紫外燈照射、過氧乙酸熏蒸、75%乙醇噴灑及空氣滅菌器等［8］。甲醛高錳酸鉀熏蒸、紫外線照射對組培材料和人體有害，安全性較差；過氧乙酸熏蒸或75%乙醇噴灑易引起組培室濕度升高；空氣滅菌器，成本投入過大，不適用于工廠化生產(chǎn)。本文針對金線蓮組培育苗污染率高的問題，分析艾葉和蒼術(shù)熏蒸對組培室空氣細(xì)菌和霉菌的滅菌效果，獲取艾葉和蒼術(shù)的優(yōu)化用量，依此比較艾葉和蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸與甲醛高錳酸鉀熏蒸、過氧乙酸熏蒸的滅菌效果，旨在篩選降低金線蓮組培污染率、降低生產(chǎn)成本、提高效率的組培室滅菌方法。

1　材料與方法

1.1材料

艾葉和蒼術(shù)購于杭州華東中藥飲片有限公司；乙醇、甲醛、高錳酸鉀、過氧乙酸為分析純試劑；采用金線蓮組培的繼代培養(yǎng)基進(jìn)行菌類培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1處理設(shè)計

設(shè)置3個艾葉用量梯度1.0，2.0，4.0 g.m-3和3個蒼術(shù)用量梯度1.0，1.5，2.0 g.m-3，分別測定組培室空氣的含菌數(shù)，獲取艾葉和蒼術(shù)的優(yōu)化用量。比較艾葉和蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸法與甲醛高錳酸鉀熏蒸法、過氧乙酸熏蒸法的滅菌效果。

1.2.2熏蒸滅菌方法

艾葉熏蒸方法。艾葉經(jīng)干燥后直接點燃熏蒸。

蒼術(shù)熏蒸方法。用95%乙醇浸泡24 h，用時以乙醇為助然劑點燃熏蒸。

甲醛高錳酸鉀熏蒸方法。甲醛2.0 m L.m-3+高錳酸鉀1.0 g.m-3熏蒸。注意將甲醛溶液倒入盛裝高錳酸鉀的容器后，人員立即撤離。

過氧乙酸熏蒸方法。20%過氧乙酸3.0 m L. m-3液置于耐熱容器中，電爐加熱熏蒸。

1.2.3菌類檢測與統(tǒng)計

采用自然沉降法測定菌類數(shù)量。打開培養(yǎng)皿蓋暴露15 min，分別在熏蒸前、后 （熏蒸后3 d）各采樣1次，在室溫下培養(yǎng)2 d，然后按霉菌、細(xì)菌進(jìn)行菌落數(shù)分類統(tǒng)計。分別在組培室的四周（距墻50 cm左右）和中間兩處共6個點進(jìn)行采樣。根據(jù)奧氏公式計算組培室空氣的含菌數(shù)（m-3），再計算得出滅菌率，分析各方法的滅菌效果。

空氣菌落總數(shù)/m-3=50 000 N/A×T。

式中：A為培養(yǎng)皿面積 （cm2），T為培養(yǎng)皿暴露時間 （min），N為培養(yǎng)皿平均菌落數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1艾葉熏蒸的滅菌效果

在不同艾葉用量梯度下，金線蓮組培室空氣滅菌效果存在差異 （表1）。

表1　艾葉不同用量熏蒸處理的滅菌效果

由表1可知，艾葉用量為4.0 g.m-3時，滅菌率最高，為60.8%～68.4%；用量為1.0 g.m-3時，滅菌率最低，為43.2%～63.9%。結(jié)果顯示，艾葉對霉菌的滅殺效果優(yōu)于細(xì)菌。隨著艾葉用量的增加，兩者間的差異降低。艾葉用量為1.0 g.m-3時，對霉菌的滅殺率與對細(xì)菌的滅殺率間的差異最大，為20.7百分點。因此艾葉用量2.0 g.m-3進(jìn)行熏蒸是工廠化生產(chǎn)較優(yōu)且經(jīng)濟的選擇。

2.2蒼術(shù)熏蒸的滅菌效果

在不同蒼術(shù)用量梯度下，金線蓮組培室空氣滅菌效果存在差異 （表2）。

表2　蒼術(shù)不同用量熏蒸處理的滅菌效果

由表2可知，蒼術(shù)用量在1.0，1.5和2.0 g. m-3時，金線蓮組培室空氣滅菌效果存在差異。蒼術(shù)對細(xì)菌的滅殺效果優(yōu)于霉菌。隨著蒼術(shù)用量的增加，兩者間差異降低。蒼術(shù)用量為1.0 g.m-3時，對細(xì)菌的滅殺率與對霉菌的滅殺率間的差異最大。用量為1.5 g.m-3時，滅菌率最高。因此采用蒼術(shù)用量1.5 g.m-3進(jìn)行熏蒸是較優(yōu)的選擇。

2.3不同熏蒸方法滅菌效果比較

由表3可知，1.0 g.m-3高錳酸鉀和2.0 mL. m-3甲醛熏蒸法總滅菌率為71.5%，滅菌后含菌量＜90 m-3，2.0 g.m-3艾葉+1.5 g.m-3蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸的總滅菌率為65.4%，滅菌后含菌量＜90 m-3，滅菌效果均達(dá)到組培對空氣質(zhì)量的要求；3.0 m L. m-3過氧乙酸熏蒸總滅菌率為67.0%，滅菌后含菌量為103 m-3。前者滅菌效果最好，后兩者滅菌效果差異不大，但甲醛高錳酸鉀與過氧乙酸對人體傷害極大，要慎用；而蒼術(shù)與艾葉聯(lián)合熏蒸法，對人體幾乎無害，且2種藥材來源廣泛，價格便宜，是一種理想的空氣滅菌替代品。

表3　不同熏蒸處理的滅菌效果

2.4艾葉和蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸法在金線蓮組培苗工廠化生產(chǎn)中的應(yīng)用效果

在金線蓮組培苗工廠化生產(chǎn)中，連續(xù)3年應(yīng)用艾葉與蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸法對組培室進(jìn)行滅菌，取得較明顯的效果。

由表4可知，與2010年相比，2012年金線蓮組培苗細(xì)菌污染下降率為1.5百分點，霉菌污染下降率為1.6百分點。艾葉與蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸法對金線蓮組培生產(chǎn)空氣滅菌效果較佳，適用于金線蓮組培苗工廠化生產(chǎn)。

表4　艾葉與蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸后的金線蓮組培污染率

3　小結(jié)與討論

艾葉、蒼術(shù)是常用中藥材，其資源豐富，價格低廉，用于熏蒸滅菌時，操作簡單易行且持續(xù)時間長久，已在醫(yī)院的手術(shù)室、母嬰產(chǎn)房、輸液室以及發(fā)熱門診等滅菌中得以應(yīng)用［9-11］，但在組培室空氣滅菌中應(yīng)用較少報道［12-13］。艾葉、蒼術(shù)熏蒸能有效地滅殺或抑制細(xì)菌和真菌，本試驗結(jié)果表明艾葉用量為2.0 g.m-3時的滅菌率為59.4%～69.0%，蒼術(shù)用量為1.5 g.m-3時的滅菌率為51.4%～59.3%；艾葉對霉菌的滅殺效果比對細(xì)菌的好，而蒼術(shù)對細(xì)菌的滅殺效果則優(yōu)于對霉菌的效果。艾葉用量2.0 g.m-3和蒼術(shù)用量1.5 g.m-3聯(lián)合熏蒸法滅菌率達(dá)到65.4%；甲醛高錳酸鉀熏蒸法滅菌率為71.5%；過氧乙酸熏蒸法滅菌率為67.0%。連續(xù)3年采用艾葉和蒼術(shù)聯(lián)合熏蒸，金線蓮組培苗的污染率均降低。

目前金線蓮組培室空氣滅菌，常采用甲醛高錳酸鉀、過氧乙酸熏蒸。甲醛能引起慢性中毒，出現(xiàn)黏膜充血、皮膚刺激、過敏性皮炎等癥，高錳酸鉀與過氧乙酸都具有較強的腐蝕性，對皮膚和呼吸道有很大的刺激性，損傷呼吸道黏膜。蒼術(shù)與艾葉聯(lián)合熏蒸具有較強的殺菌作用，且效果持續(xù)時間長，對人體幾乎無傷害，克服了傳統(tǒng)滅菌方法的缺點，具有安全、高效、無毒害副作用的特點，是金線蓮組培生產(chǎn)中一種理想的空氣滅菌替代品。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 567

B

0528-9017（2015）12-1999-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20151226

2015-06-24

寧波市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目 （2014C10013）；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計劃項目 （2014C32017）

張望舒 （1979-），女，浙江臨海人，高級工程師，博士，主要從事植物栽培與育種研究工作。E-mail：zjuzws@ hotmail.com。