沈　佳，壽偉松，張躍建

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021）

甜瓜翠雪5號的二維碼構(gòu)建及種子純度分子檢測技術(shù)

沈佳，壽偉松，張躍建*

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021）

為建立雜交甜瓜種子純度快速檢測體系，本研究以甜瓜新品種翠雪5號為例，采用已報道的18對甜瓜基因組高多態(tài)性的SSR標記構(gòu)建翠雪5號親本的指紋圖譜并建立易于識別的數(shù)字化二維碼。在篩選獲得兩親本材料多態(tài)性SSR標記的基礎(chǔ)上，本研究利用這些多態(tài)性分子標記對隨機挑選的100株F1單株進行了純度鑒定。結(jié)果表明，18對SSR標記中有9對標記在親本材料之間具有差異性，多態(tài)性比例達到了50%。采用這些多態(tài)性標記對翠雪5號種子鑒定純度為100%，與田間鑒定結(jié)果一致。這些結(jié)果表明本研究選取的18對甜瓜基因組分子標記組成的指紋圖譜及構(gòu)建的二維碼可以為翠雪5號知識產(chǎn)權(quán)保護提供確切的依據(jù)。同時本研究獲得的9對多態(tài)性SSR分子標記可用于快速鑒定翠雪5號種子純度，保障該品種的種子質(zhì)量。

甜瓜；翠雪5號；指紋圖譜；二維碼；純度鑒定

文獻著錄格式：沈佳，壽偉松，張躍建.甜瓜翠雪5號的二維碼構(gòu)建及種子純度分子檢測技術(shù) ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2015，56（12）：1946-1949.

甜瓜（Cucumismelo L.）俗稱甘瓜或香瓜，是世界上重要的果用蔬菜作物。我國為世界上最大的甜瓜生產(chǎn)和消費國，甜瓜種子生產(chǎn)量大而集中。由于國內(nèi)甜瓜種子市場尚不規(guī)范，種子品牌魚龍混雜，極大地影響了育種單位和農(nóng)戶的利益，常發(fā)生種子質(zhì)量糾紛。目前甜瓜雜交種子生產(chǎn)中主要包括人工去雄、套袋等技術(shù)環(huán)節(jié)［1］，殘留的花粉容易導致自交種子的產(chǎn)生，致使種子純度一般難以達到100%［2］，造成商品種子質(zhì)量下降，給生產(chǎn)帶來重大損失。因此，種子的真實性和純度是評價甜瓜種子質(zhì)量最主要的因素。

目前，鑒定甜瓜雜交種子純度主要依靠田間種植檢測法，根據(jù)形態(tài)學特征進行判斷，鑒定周期長，需要耗費大量人力、物力，且易受環(huán)境因素及基因顯隱性的影響［3］。隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，特別是基于DNA分子標記的發(fā)展，在推動作物育種方式變革的同時，也為作物品種純度鑒定開辟了一個新的途徑。目前，DNA分子標記以其高度的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，已被廣泛用于作物種子的質(zhì)量檢測［4］。SSR標記技術(shù)，憑借其豐富的多態(tài)性、共顯性遺傳以及操作簡單等優(yōu)點，是近些年鑒定品種和進行種子純度分析的一種較為理想的DNA分子標記技術(shù)，已被納入農(nóng)作物種子品種純度鑒定的國家標準［5］。近年來隨著甜瓜基因組序列信息的公布，越來越多的甜瓜SSR等分子標記被開發(fā)應用，推動了甜瓜育種研究的同時也為甜瓜種子純度鑒定奠定了基礎(chǔ)。2012年，Gao等［6］通過對1 219對甜瓜基因組SSR引物篩選，獲得了具有較高多態(tài)性的18對SSR引物，為甜瓜指紋圖譜的快速構(gòu)建提供了保證。

翠雪5號系浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所最新育成的品種，對白粉病、蔓枯病等病害有較高的抗性，具有較大的推廣應用前景。本文利用已報道的甜瓜核基因組SSR標記，同時借鑒已開發(fā)的甜瓜屬作物黃瓜的線粒體基因組SSR標記，構(gòu)建翠雪5號及其親本材料的指紋圖譜及數(shù)字二維碼，為該品種的知識產(chǎn)權(quán)保護以及雜種純度鑒定提供理論依據(jù)及技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料種植

供試甜瓜翠雪5號單株以及親本材料 （高代自交系材料）由浙江省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所西甜瓜課題組提供。于2015年4月上旬催芽后播種，4月下旬定植于海寧楊渡基地大棚設(shè)施內(nèi)。大棚寬8 m，長32 m，棚面積256 m2，小區(qū)面積9.6 m2，每小區(qū)定植24株。F1單株材料采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，5次重復；親本種植于兩個小區(qū)，定植24株。苗期隨機挑選100株F1單株，20株親本單株掛牌取樣，放置于 -80℃冰箱，用于后續(xù)的 SSR分析及田間性狀調(diào)查。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA提取

采用CTAB法［7］提取100株F1單株以及親本材料各20株單株的幼嫩葉片基因組DNA，并用Nanodrop（Thermo，美國）檢測DNA質(zhì)量及濃度。各個樣品DNA濃度稀釋到50 ng.μL-1，并將20個親本材料DNA等量混合，用于親本材料多態(tài)性標記的篩選。

1.2.2PCR擴增及電泳檢測

18對甜瓜核基因組 SSR引物來自 Gao等［6］，具體信息見表1，由上海英駿生物科技公司合成。SSR總反應體系為20μL，包括50 ng DNA模板，前后引物各1μmol.L-1，2×PCR Master Mix（杭州寶賽生物公司，中國）10μL。為了同時滿足不同引物退火溫度的要求，SSR擴增采用 “touchdown”PCR程序［8］，具體反應程序為94℃預變性2 min；94℃變性20 s，68℃退火1 min，72℃延伸30 s，6個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低2℃；94℃變性20 s，58℃退火1 m in，72℃延伸30 s，9個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低1℃；94℃變性20 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，15個循環(huán)；最后72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳，180 V穩(wěn)壓電泳2～2.5 h后銀染顯色，在醫(yī)用顯影燈下觀察實驗結(jié)果。

表1　所用的引物序列

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計及指紋圖譜構(gòu)建

針對甜瓜核基因組 SSR標記的條帶大小及分布，參考宋海斌等［9］的方法，將18對核基因組SSR引物依次編碼為A，B，C……，然后依據(jù)每對引物擴增片段的分子量從大到小的順序記錄條帶的分子量，形成字幕和阿拉伯數(shù)字組成的一系列編碼，形成該材料的核基因組SSR指紋圖譜代碼。再將材料的名稱類型以及對應的 SSR指紋圖譜代碼轉(zhuǎn)換成二維碼。

1.2.4田間純度鑒定

授粉坐瓜后30 d，針對已經(jīng)取樣掛牌的100個F1單株進行田間純度鑒定，主要針對甜瓜果實性狀進行統(tǒng)計，分別測定果重、果實縱徑、果實橫徑、果形指數(shù)、中心折光糖度、邊緣折光糖度以及果型、果皮顏色及特征、果肉色澤、果肉質(zhì)地與口感等。

2　結(jié)果與分析

2.1親本多態(tài)性引物篩選

基于前人的研究報道，本研究采用在甜瓜群體中具有高多態(tài)性表現(xiàn)的18對甜瓜基因組SSR引物對兩個親本DNA進行擴增，經(jīng)電泳檢測，每對引物的擴增位點為1～2個，片段大小為100～600 bp。如圖1中的2和3泳道所示，9對引物（MU4104-1，CMBR097，MU9175-1，SSR00398，CMBR002，ECM147，MU5554-1，ECM150和CMBR052）在親本間具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為50%。這些具有多態(tài)性的SSR引物可用于下一步雜交種子純度的鑒定工作。同時，各引物在親本材料中僅僅得到單一的主帶，說明經(jīng)過高代自交后（＞10代自交純化），翠雪5號親本材料雜合位點較少，處于高度的純合狀態(tài)。這為準確區(qū)分親本材料，構(gòu)建親本材料的DNA指紋圖譜提供了保證。當然這也是雜交制種的前提，避免了后代的分離。

圖1　9對核基因組SSR引物在部分雜交種翠雪5號以及親本材料的擴增結(jié)果電泳圖

2.2指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)試驗方法，針對18對甜瓜核基因組SSR擴增的條帶大小，構(gòu)建了翠雪5號親本材料母本以及父本的核基因組SSR指紋圖譜代碼，分別為：A180B270C100D200E195F200G275H240I120J200K2 00L240M200N200O205P175Q190R115、A180B270C120D200E195F220G290H240I130J200K165L240M24 0N245O185P200Q190R115。因此，翠雪5號的理論SSR指紋圖譜代碼為A180B270C100-120D200E 195F200-220G275-290H240I120-130J200K200-165L2 40M200-240N200-245O205-185P175-200Q190R115。然后利用在線工具碼云QR-Code（二維碼）在線生成器（http：//codeyun.sinaapp.com/qrcodegen/），我們將材料對應的名稱，類型，以及指紋代碼生成統(tǒng)一識別的指紋圖譜二維碼。如圖2，A包含了下列信息：名稱：翠雪5號母本，類型：甜瓜高代自交系，指紋代碼，A180B270C100D200E195F200 G275H240I120J200K200L240M200N200O205P175Q1 90R115；B包含了下列信息：名稱：翠雪5號父本，類型：甜瓜高代自交系，指紋代碼，A180B270C 120D200E195F220G290H240I130J200K165L240M24 0N245O185P200Q190R115；C包含了下列信息：名稱：翠雪5號，類型：甜瓜雜種F1，指紋代碼，A180B270C100-120D200E195F200-220G275-290H240I120-130J200K200-165L240M200-240N200-245O20 5-185P175-200Q190R115。一份材料對應一個唯一的二維碼信息，信息更加全面，在方便進行統(tǒng)一管理的同時利于品種的識別及知識產(chǎn)權(quán)的保護。

圖2　翠雪5號親本及雜種F1的指紋圖譜對應的二維碼

2.3雜交種F1純度分子鑒定

利用9對多態(tài)性的核基因組SSR標記（MU4104-1，CMBR097，MU9175-1，SSR00398，CMBR002，ECM147，MU5554-1，ECM150和CMBR052），對100株F1進行鑒定。結(jié)果顯示，9對核基因組標記在100個F1單株中均擴增出了含有雙親條帶的雜合帶型，表明這100株單株為雙親的雜交種 （圖1），體現(xiàn)了制種過程中去雄工作的徹底性以及防控污染的有效性。這9對DNA分子標記鑒定的結(jié)果表明，該100株單株都是真正的雜交種。因此，今后的鑒定工作中我們可以隨意挑選其中的1～2對多態(tài)性SSR標記即可快速完成對翠雪5號種子純度的鑒定，保障種子質(zhì)量。

2.4雜交種F1純度田間鑒定

在甜瓜結(jié)果期對已經(jīng)標記的100株翠雪5號單株進行田間性狀的觀察統(tǒng)計，所有單株性狀表現(xiàn)型一致，所統(tǒng)計的農(nóng)藝性狀均符合翠雪5號甜瓜的性狀描述，顯示為真雜交種。因此，田間鑒定結(jié)果表明，該100株單株的品種純度為 100%，沒有混雜，與分子鑒定結(jié)果一致。

3　討論

近年來，盡管國內(nèi)育種單位對種子質(zhì)量的控制越來越嚴格，但是低劣種子造成的生產(chǎn)事件還是時有發(fā)生，不僅影響種子的聲譽及企業(yè)的利益，還會導致作物產(chǎn)量不穩(wěn)定，影響農(nóng)民的經(jīng)濟效益。傳統(tǒng)的采用田間性狀等方法鑒定雜交種子質(zhì)量，由于經(jīng)常受限于環(huán)境影響，鑒定周期長，且結(jié)果不一定可靠。而基于DNA分子標記開展品種鑒定，具有多態(tài)性水平高、穩(wěn)定性好、不受環(huán)境因素影響等優(yōu)點，短時間內(nèi)就可以準確鑒定種子純度，為作物育種及品種保護提供了便利［10］。本研究采用簡單易操作的18對核基因組 SSR分子標記檢測了翠雪5號親本材料的基因型，結(jié)果顯示，9對標記在親本材料之間存在多態(tài)性，多態(tài)性達到了50%。通過上述試驗結(jié)果，本研究成功構(gòu)建了翠雪5號及其親本材料的指紋圖譜及二維碼標簽，為甜瓜品種保護提供了確切依據(jù)。同時，這9對多態(tài)性的SSR標記可有效應用于甜瓜新品種翠雪5號種子純度的快速鑒定，為其大面積推廣應用奠定了堅實的基礎(chǔ)。

在實際生產(chǎn)過程中，甜瓜雜交種子純度通常達不到100%的主要原因是雜交制種過程中去雄不徹底，導致產(chǎn)生少量自交種混雜。所以，甜瓜種子純度鑒定的核心是鑒別自交產(chǎn)生的種子?；?SSR分子標記的共顯性特性，在得到親本材料間多態(tài)性標記的前提下，理論上能夠利用單對標記對雜交單株進行分析，快速區(qū)分雜交種和自交種。當然，在開放的制種環(huán)境下，對于其他花粉污染產(chǎn)生的外來雜交種混雜，則需要多對SSR標記進行驗證，在排除自交種的同時，準確判斷父本花粉來源，提高純度檢測的精確性。

［1］ 王薇，陳志剛，喬宏宇，等.用雌性系配制的薄皮甜瓜新品種 “農(nóng)大8號”［J］.園藝學報，2013，40（12）：2547-2548.

［2］ 李菊芬，許玲，馬國斌.應用SSR分子標記鑒定甜瓜雜交種純度 ［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2008，16（3）：494-500.

［3］ 辛景樹，郭景倫，張軟斌.幾種常用分子標記技術(shù)在種子純度和品種真實性鑒定方面的比較與分析 ［J］.種子，2005，24（1）：58-60.

［4］ 張紅，喻梅輝，周志成，等.甜瓜分子標記純度鑒定研究［J］.中國瓜菜，2006（1）：7-10.

［5］ 艾呈祥，陸璐，馬國斌，等.SSR標記技術(shù)在甜瓜雜交種純度檢驗中的應用 ［J］.園藝學報，2005，32（5）：902-904.

［6］ Gao P，Ma H，Luan F，et al.DNA fingerprin ting of Chinese melon provides evidentiary support of seed quality appraisal ［J］.PLoSOne，2012，7（12）：e52431.

［7］ 李榮華，夏巖石，劉順枝，等.改進的CTAB提取植物DNA方法 ［J］.實驗室研究與探索，2009，28（9）：14-16.

［8］ Weng Y，Li W，Devkota R，et al.M icrosatellite markers associated with two Aegilops tauschii-derived greenbug resistance loci in wheat［J］.Theoretical and Applied Genetics，2005，110（3）：462-469.

［9］ 宋海斌，崔喜波，馬鴻艷，等.基于SSR標記的甜瓜品種（系）DNA指紋圖譜庫的構(gòu)建 ［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45（13）：2676-2689.

［10］ 王美榮，許勇，詹永樂，等.厚皮甜瓜品種組合SSR指紋圖譜構(gòu)建 ［J］.中國農(nóng)學通報，2010，26（20）：47-51.

（責任編輯：張 韻）

S 652

A

0528-9017（2015）12-1946-04

10.16178/j.issn.0528-9017.20151211

2015-09-11

浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項 （2012C12903）

沈 佳（1987-），男，浙江嘉興人，博士，從事蔬菜遺傳育種研究工作。E-mail：sjia-2009@hotmail.com。

張躍建。E-mail：zhang292001@yahoo.com.cn。