劉洋,劉林嶓

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科河南鄭州450052）

抗原負(fù)載的DC-CIK聯(lián)合化療治療晚期惡性黑色素瘤的臨床研究

劉洋,劉林嶓

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科河南鄭州450052）

目的：研究抗原負(fù)載的DC-CIK過繼免疫療法聯(lián)合化療對(duì)晚期惡性黑色素瘤的臨床療效。方法：選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的60例晚期惡性黑色素瘤患者,28例行抗原負(fù)載的DC-CIK聯(lián)合化療（A組）,32例行單純化療（B組），對(duì)兩組患者治療后免疫功能、生活質(zhì)量、中位生存期及無進(jìn)展生存期進(jìn)行比較。結(jié)果：A組治療后外周血中CD3+,CD3+/CD4+,CD3+/CD8+,CD4+/CD8+和CD16+/CD56+細(xì)胞比值無明顯變化，（＞0.05）；B組治療后外周血中T細(xì)胞亞群比例較之前顯著下降,（＜0.05）。A組行細(xì)胞回輸結(jié)束后，QOL評(píng)分改善比例為57.1%，與B組改善率31.2%而言，（＜0.05）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組患者的無進(jìn)展生存期(月)較B組患者長（16vs9，＜0.05），A組與B組患者的總生存期，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)論：抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合化療治療晚期惡性黑色素瘤安全有效，在提高患者免疫功能、減輕化療不良反應(yīng)、延長無進(jìn)展生存期和改善患者生活質(zhì)量方面具有重要作用。

樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；惡性黑色素瘤；化療

黑色素瘤是一種臨床上發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，年增長率為3%～5%，雖然在我國發(fā)病率較低，但近年來成倍增長，每年新發(fā)病例約2萬例，它已經(jīng)成為嚴(yán)重危及我國人民健康的疾病之一[1]，截止目前，惡性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)的治療方法有手術(shù)、放療、化療、輔助治療，其中手術(shù)治療依然是最主要治療方法，但術(shù)后存在的微小轉(zhuǎn)移灶往往成為復(fù)發(fā)的主要因素[2]。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells,DC）聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cells，CIK）過繼性細(xì)胞免疫治療（adoptivecellular immunotherapy，ACI）可以在不損傷機(jī)體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。DC已被證明是目前所發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的(antigen presenting cells,APC),它可以促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和輔助性T淋巴細(xì)胞的生成，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)[3]。CIK是一個(gè)強(qiáng)大的抗腫瘤活性細(xì)胞群，并通過發(fā)揮自身的細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子而殺傷腫瘤細(xì)胞，并可清除患者體內(nèi)微小殘余病灶。DC識(shí)別抗原、激活獲得性免疫系統(tǒng)，與CIK聯(lián)合確保了一個(gè)高效的免疫系統(tǒng)。本研究應(yīng)用抗原負(fù)載的DC-CIK聯(lián)合化療治療Ⅲ～Ⅳ期MM28例（A組），對(duì)比單純化療組32例（B組），評(píng)價(jià)聯(lián)合組治療MM的臨床療效。

1　資料和方法

1.1研究對(duì)象及入選標(biāo)準(zhǔn)

選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的60例MM晚期患者（根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）YNM分期為Ⅲ～Ⅳ期）,并均經(jīng)病理確診。根據(jù)患者自愿選擇治療方案，分為抗原負(fù)載的DC-CIK聯(lián)合化療組（A組）28例，32例為單純化療組（B組）。治療前均向患者或家屬告知病情、詳細(xì)診療方案及有可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，簽署治療知情同意書。入組標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未接受放化療；②卡式評(píng)分＞60分；預(yù)計(jì)生存期＞6個(gè)月；③心、肝、腎等臟器功能無明顯異常。

1.2主要試劑與儀器

試劑：自體外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津瀚洋生物制藥科技有限責(zé)任公司，重組人纖維蛋白（RetroNectin）購自北京寶日生物工程有限公司，抗CD3單克隆抗體購自美國BD公司，細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640購自友康基業(yè)生物科技（北京）有限公司，胎牛血清購自HyClone公司，IL-2購自山東泉港藥業(yè)有限公司，IFN-γ、IL-1α購自美國BD公司，400目細(xì)胞篩購自北京欣經(jīng)科公司。儀器：流式細(xì)胞儀（美國BD公司）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司）。

1.3抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞的培養(yǎng)與制備

首先，患者空腹8h以上，抽取外周血60ml加入肝素鈉抗凝并均勻注入含淋巴細(xì)胞分離液，并經(jīng)過離心純化得到得到外周血單核細(xì)胞（PBMC），將獲得的PBMC加含慶大霉素的生理鹽水并低溫離心洗滌2次，取含5%自體血漿的GTT-551（TaKra）無血清培養(yǎng)基30ml，將計(jì)數(shù)為1×107外周血單核細(xì)胞懸浮于其上，取經(jīng)RetroNectin和抗mCD3Ab包被好的75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶一組，傾倒里面的液體，再分別用GTT-551和PBS液沖洗1次，培養(yǎng)當(dāng)天在培養(yǎng)基中加入IFN-γ及IL-2，并取30ml轉(zhuǎn)至RN包被的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放置培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)，將GTT-551培養(yǎng)基中加入1000 U/ml的IL-2及2%的自體血漿配置成CIK細(xì)胞擴(kuò)瓶培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第8天或者第9天時(shí)獲得CIK細(xì)胞。其次，收集貼壁2 h后PBMNC中的貼壁成分作為前體細(xì)胞，以2×106個(gè)/ml濃度加入含GM-CSF 1 000U/ml，IL-4 1 000 U/ml的AIM-V，5%C02，37℃培養(yǎng)，每3d半量換液1次。培養(yǎng)細(xì)胞至第5天，加入腫瘤抗原液刺激，至第7天加入TNF-α，第8天收獲的細(xì)胞為負(fù)載腫瘤抗原的DC，然后將CIK細(xì)胞和負(fù)載抗原的DC細(xì)胞混合繼續(xù)培養(yǎng)3d獲得腫瘤抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞

1.4治療方案

所有患者手術(shù)治療原則均按照中國黑色素瘤診療指南（2011版）實(shí)施。術(shù)后治療方案為：

A組聯(lián)合方案：達(dá)卡巴嗪（DTIC廣東嶺南制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20055753），300mg/m2，并50g/L葡萄糖溶液500mL稀釋后靜脈滴注，每日一次，連用5d為1個(gè)周期，一般間歇3周重復(fù)給藥，連用2個(gè)周期。聯(lián)合治療組患者均為化療前采集外周靜脈血，每次化療后回輸抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞，每次連續(xù)回輸3d，并在每次細(xì)胞回輸后輔助IL-2，100萬IU，皮下注射，強(qiáng)化細(xì)胞療效。

B組單純化療方案：DTIC，方法、藥物劑量及周期均同A組。兩組患者化療期間均輔助止吐、退熱、促進(jìn)造血等對(duì)癥及支持治療。

1.5療效評(píng)價(jià)

1.5.1免疫功能評(píng)價(jià)：根據(jù)T細(xì)胞亞群檢測評(píng)價(jià)患者免疫功能，包括CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD4+/CD8+和CD16+/CD56+的變化，細(xì)胞回輸前及治療結(jié)束后10天，用流式細(xì)胞儀檢測外周血中上述指標(biāo)。

1.5.2生活質(zhì)量評(píng)價(jià)：應(yīng)用Karnofsky評(píng)分（Quality of life，QOL）[4]變化，以治療后KPS增加≥10分為QOL改善，變化＜10分為QOL穩(wěn)定，減少≥10分為QOL降低。細(xì)胞回輸過程中，觀察患者有無過敏、休克等不良反應(yīng)。

1.5.3遠(yuǎn)期療效評(píng)價(jià)：無進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）指從隨機(jī)分組開始到腫瘤進(jìn)展或死亡的時(shí)間；總生存期（overall survival，OS）為治療開始至患者死亡或最后一次隨訪時(shí)間。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±）表示，兩組二分類資料比較用2檢驗(yàn)；生存資料采用Kaplan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

表1　A組和B組之間的臨床特征比較

2　結(jié)果

2.1臨床資料

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，治療組和對(duì)照組患者的一般資料比較具有可比性，見表1。

表2　兩組患者治療前后外周血腫T淋巴細(xì)胞亞群變化（±，%）

表2　兩組患者治療前后外周血腫T淋巴細(xì)胞亞群變化（±，%）

*＜0.05vs聯(lián)合治療前；△＜0.05vs單純化療前

組別A組CD3+CD3+/CD4+CD3+/CD8+CD4+/CD8+CD16+/CD56+治療前治療后B組治療前治療后72.4±13.3 75.5±14.2*39.3±6.3 36.6±4.5*22.8±6.1 25.7±6.3*1.73±1.51 2.06±0.82*7.5±2.4 8.6±2.3 73.5±12.9 44.6±8.3△41.1±7.4 26.2±4.3△25.8±7.4 19.2±7.9△1.82±1.61 0.65±2.31△8.2±3.1 3.1±2.8

表3　兩組患者治療前后生活質(zhì)量改變情況

2.2 T細(xì)胞亞群變化

A組抗原負(fù)載的DC-CIK細(xì)胞回輸聯(lián)合DTIC化療后CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD4+/CD8+和D16+/CD56+細(xì)胞比值無明顯變化，（＞0.05）；B組單純化學(xué)治療后外周血中T細(xì)胞亞群比例較治療之前顯著下降，（＜0.05）；且治療后A組T淋巴細(xì)胞亞群測定值大于B組，（＜0.05）（表2）。由此可見化療組降低了患者的免疫功能，而抗原負(fù)載的DC-CIK的細(xì)胞回輸可以改善患者的免疫功能。

2.3生活質(zhì)量改變

A組行細(xì)胞回輸結(jié)束后，QOL評(píng)分改善比例為57.1%，與B組改善率31.2%而言，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=-2.370,=0.018)見表3。

2.4兩組晚期MM患者中位PFS及中位OS評(píng)價(jià)

A組患者術(shù)后細(xì)胞回輸聯(lián)合化療后，中位無進(jìn)展生存期（月）明顯高于B組（16vs9）,(2=8.100，=0.004)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。A組患者中位生存時(shí)間（月）明顯高于B組（38vs18）,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=3.107，=0.078)，見圖2。

圖1a　組與B組PFS曲線

3　討論

晚期MM患者預(yù)后差，研究發(fā)現(xiàn)它的發(fā)病與免疫逃逸與免疫耐受密切相關(guān)，其中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與免疫逃逸最為密切。Sasada[5]等研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，腫瘤病人外周血中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞明顯較高；Beyer M[6]等認(rèn)為腫瘤患者預(yù)后情況與腫瘤患者局部調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)；李花等[7]的研究證實(shí)經(jīng)DC誘導(dǎo)CIK后，解除了調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞對(duì)CIK的抑制功能，使外周血中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少的同時(shí)，也顯著增強(qiáng)了殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。而化療也可以減少調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，從而改善機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)[8]。

DC是人體內(nèi)功能強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，可以激活初始T淋巴細(xì)胞，引發(fā)抗原特異性的免疫應(yīng)答。它的抗腫瘤機(jī)制主要由以下幾點(diǎn)：①成熟的DC細(xì)胞能夠捕獲不同類型的抗原，加工處理后，通過細(xì)胞表面表達(dá)的MHC分子及表面標(biāo)志白細(xì)胞分化抗原CD1分子途徑，啟動(dòng)T細(xì)胞能力，從而抵制腫瘤的免疫逃逸[9]；②DC細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子選擇性的趨化T細(xì)胞，并將趨化的T細(xì)胞定向遷徙至腫瘤部位；③在腫瘤周圍，DC細(xì)胞與T細(xì)胞之間會(huì)相互產(chǎn)生作用，同時(shí)濾泡型DC細(xì)胞會(huì)保留一些抗原，可使DC分泌一些促進(jìn)T細(xì)胞生長增殖的生存因子，從而延長效應(yīng)T細(xì)胞在腫瘤部位的殺傷時(shí)間；④DC細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子如（IL-12、IFN-1）等從而抑制腫瘤血管形成[10]。

CIK細(xì)胞是人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，其表面標(biāo)記CD3CD56為雙陽性，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性與NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點(diǎn)[9]它的抗腫瘤作用機(jī)制為以下三種[11-13]：①直接殺傷: CIK細(xì)胞可以通過不同的機(jī)制識(shí)別腫瘤細(xì)胞，釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解；②CIK細(xì)胞可以釋放大量IL-2、IL-10、TNF-α等多種細(xì)胞因子，通過抑制腫瘤細(xì)胞生存及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞；③CIK細(xì)胞通過跨膜糖蛋白從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

諸多研究表明DC與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)后產(chǎn)生的細(xì)胞比同源CIK細(xì)胞的增殖活性更強(qiáng)，并能加強(qiáng)CIK細(xì)胞的抗腫瘤活性。兩者共同培養(yǎng)后，可使IL-2、IL-12、IFN-γ等細(xì)胞因子分泌增加，反過來細(xì)胞因子又可加快CIK細(xì)胞的增殖速度[14]。當(dāng)DC分泌大量的IL-12,促使CIK細(xì)胞高表達(dá)CD56+，進(jìn)一步提高CIK細(xì)胞的毒性和抗腫瘤作用。另外DC可以在一定程度上抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞活性，進(jìn)而增強(qiáng)CIK細(xì)胞的殺傷性，因此DC-CIK聯(lián)合治療是目前臨床上應(yīng)用最有效的過繼性免疫治療的方法之一[15]。

程霞等[16]指出當(dāng)腫瘤負(fù)荷低于1×106時(shí)，免疫治療可能獲得比較好的療效。術(shù)后輔助化療后，體內(nèi)對(duì)化療敏感的殘存腫瘤細(xì)胞，部分得到清除，但也損害了機(jī)體免疫功能，此時(shí)如再適當(dāng)?shù)妮o助生物細(xì)胞回輸治療，可清除術(shù)后微小病灶的同時(shí)修復(fù)受損的免疫功能[17]，本次的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，A組治療后外周血中CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD4+/CD8+和CD16+/CD56+細(xì)胞比值無明顯變化，（＞0.05）；B組治療后外周血中T細(xì)胞亞群比例較之前顯著下降。另外石永進(jìn)等[18]研究發(fā)現(xiàn)：有關(guān)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞降低乳腺癌耐藥細(xì)胞系對(duì)阿霉素的耐受效應(yīng)指出CIK與化學(xué)治療聯(lián)合應(yīng)用可提高耐藥腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感性，并減輕化學(xué)治療所帶來的不良反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞MHCⅠ類分子及共刺激分子是效應(yīng)T細(xì)胞識(shí)別、殺傷腫瘤細(xì)胞的重要途徑?；熕幬锟烧T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞MHCⅠ類分子的表達(dá)[19]，從而介導(dǎo)更為有效的DC-CIK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力[20]。

本研究建立在抗原負(fù)載的DC上，利用DC提呈抗原的能力來完成對(duì)腫瘤的選擇，從而誘導(dǎo)出針對(duì)腫瘤抗原的T細(xì)胞克隆，協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生更大的抗腫瘤效應(yīng)。

王忠成[21]等對(duì)抗原負(fù)載的DC-CIK與抗原負(fù)載的DC對(duì)B16惡性黑色素瘤荷瘤鼠的治療作用對(duì)比分析后認(rèn)為抗原負(fù)載的DC－CIK和DC有明顯的抗腫瘤作用。劉希春[22]等用NVD修飾胃癌細(xì)胞抗原后，再用特異性DC-CIK細(xì)胞進(jìn)行殺傷，取得了前所未有的治療效果，殺傷率達(dá)到83.4%。任鵬濤等[23]指出單純應(yīng)用CIK細(xì)胞組和未進(jìn)行特異性抗原負(fù)載的DC-CIK兩組的抑瘤率以及細(xì)胞殺傷試驗(yàn)中細(xì)胞殺傷情況均低于特異性抗原負(fù)載的DC-CIK。這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞總蛋白中包含有豐富的MHC抗原表位成分，進(jìn)過特異性抗原致敏的DC細(xì)胞的攝取、加工和遞呈后，可誘導(dǎo)針對(duì)該特異性抗原的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮有效的抗腫瘤效應(yīng)。所以通過特異性抗原負(fù)載的DC和同期激活的CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)，來進(jìn)一步提高效應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)量、增強(qiáng)抗腫瘤細(xì)胞毒性、增加細(xì)胞因子的分泌能力、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而為臨床提供一種安全、有效的腫瘤免疫治療途徑。本研究結(jié)果顯示，A組治療結(jié)果顯示中位PFS （16vs9）上明顯比B組長，過敏、休克、腹瀉、皮疹以及白細(xì)胞降低等不良反應(yīng)的發(fā)生率也較低，且A組患者QOL評(píng)分改善比例為57.1%，與B組改善率31.2%而言也得到了很大的提高（＜0.05），但該治療模式仍需要臨床上大樣本的研究來進(jìn)一步證實(shí)。另有研究發(fā)現(xiàn)特異性抗原致敏的DC-CTL細(xì)胞較DC-CIK細(xì)胞而言有更強(qiáng)大的殺傷B16黑色素瘤細(xì)胞的能力并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[24]，其機(jī)制仍需進(jìn)一步探索，希望在不久的將來能為臨床腫瘤的過繼免疫治療提供更好的治療方式。

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編輯/張惠娟

Clinical study on DC-CIK loaded with antigen combined with chemotherapy in the treatment of end-stage malignant melanoma

LIU Yang,LIU Lin-bo
(Department of Plastic Surgery,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,Hennan,China)

Objective To evaluate the therapeutic effect of dendritic cells-cytokine icduced killers cells (DC-CIK)loaded with antigen chemotherapy in the treatment of end-stage malignant melanoma(MM). Methods 60 MM patients were selected from the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University.28 of them were treated by DC-CIK loaded with antigen with chemotherapy(A group),and another 32 were treated by chemotherapy only(B group).The immune function,quality of life(QOL),the medianprogression-free survival(mPFS)and overall survival(OS)of the patients were compared between the two groups after the treatment.Results There was no obvious change of the ratio of CD3+,CD3+/CD4+, CD3+/CD8+,CD4+/CD8+and CD16+/CD56+in the peripheral blood of group A(＞0.05),while T cell subsets decreased significantly after the treatment of group B,and obviously lower than that of group A(＜0.05). 57.1%of patients in group A were improved in their quality of life,significantly higher than that of B group,which was 31.2%(＜0.05).The median progression-free survival(mPFS)of group A was longer than that of group B(16 months vs 9 months，＜0.05),while the median overall survival(OS)of the two groups had no significant difference(＞0.05).ConclusionsTreatment with DC-CIK adoptive immunotherapy combined with chemotherapy can improve effectively the immune function and reduced the side effects of chemotherapy,prolong the PFS,and improve QOL of end-stage MM patients.

dendritic cells(DC);cytokine induced killer cells(CIK);malignant melanoma;chemotherapy

R739.5

A

1008-6455（2015）02-0025-06

劉林嶓，主任醫(yī)師、教授、主任(病區(qū)負(fù)責(zé)人)；研究方向：體表腫瘤、病理性瘢痕、皮膚軟組織損傷、美容外科等；通聯(lián)：河南省鄭州市中原區(qū)建設(shè)東路1號(hào)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科，郵編：450052

2014-11-22

2015-01-05