曾恕芬，陳金東*，任楊帆，陳榮潔

(1.云南維和藥業(yè)股份有限公司，云南 玉溪 653100；2.云南省植物提取物工程研究中心，云南 玉溪 653100)

·中藥工業(yè)·

熟三七配方顆粒的質(zhì)量分析研究

曾恕芬1，2，陳金東1，2*，任楊帆1，2，陳榮潔1，2

(1.云南維和藥業(yè)股份有限公司，云南 玉溪 653100；2.云南省植物提取物工程研究中心，云南 玉溪 653100)

目的：進(jìn)行熟三七配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，建立質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為科學(xué)評(píng)價(jià)其質(zhì)量提供依據(jù)。方法：采用薄層色譜法(TLC)對(duì)熟三七配方顆粒中人參皂苷Rh1、Rg3進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)其三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd進(jìn)行含量檢測(cè)分析。結(jié)果：建立了熟三七配方顆粒中人參皂苷Rh1、Rg3的薄層鑒別方法；建立了檢測(cè)熟三七配方顆粒中三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量測(cè)定方法。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、專屬性好，能有效對(duì)熟三七配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

熟三七配方顆粒；高效液相色譜；薄層色譜法

三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根莖，具有散瘀止血、消腫定痛的作用。臨床上多用于治療咯血、吐血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛、跌打腫痛[1]。三七中的主要成分是達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷，主要有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd[1-2]。三七經(jīng)蒸制后變成熟三七，有部分原生皂苷成分將轉(zhuǎn)化成人參皂苷20(R)-Rh1、20(S)-Rh1、20(R)-Rg3、20(S)-Rg3、Rh4、Rk3、Rg5、Rk1[3-4]。試驗(yàn)研究表明，轉(zhuǎn)化后形成的次生皂苷中人參皂苷Rh1、Rg3的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定。本文采用高效液相色譜法與薄層色譜鑒別方法相結(jié)合的方式，對(duì)熟三七配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行分析研究，為中藥配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

本文中使用的三七原料采購(gòu)于文山中藥材市場(chǎng)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所楊崇仁研究員鑒定為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen 的干燥根。經(jīng)檢驗(yàn)各指標(biāo)成分符合《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部中中藥材三七的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本文中使用同一批號(hào)的三七，經(jīng)炮制加工，制備成不同批次的熟三七飲片，經(jīng)檢驗(yàn)熟三七飲片符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)WS-11219(ZD-1219)-2002-2012Z的規(guī)定。再用不同批次熟三七飲片制備成不同批次的熟三七配方顆粒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent1200型)；MILLIPORE超純水器(美國(guó)密理博公司)；美國(guó)丹佛雙量程電子天平(TB-215D)；天津恒奧超聲波清洗器(HU10260 B)；硅膠板(山東青島海洋化工)。

1.2 試藥

熟三七配方顆粒(自制，批號(hào)分別為20131105，20131109，20131111，20131010，20131021，20131030，20131204，20131216，20131229，20140110)；10%的硫酸乙醇溶液、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲醇、乙腈(德國(guó)默克公司)；水為超純水；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd、三七皂苷R1(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110745-200312，110703-200322，110703-200322，110704-200319，110704-200319)。

2 方法

2.1 薄層色譜法

試驗(yàn)前，首先通過(guò)對(duì)樣品不同提取方法、純化方法、展開(kāi)系統(tǒng)、展開(kāi)劑、硅膠G板、點(diǎn)樣量、溫濕度、平衡時(shí)間、重復(fù)性試驗(yàn)等進(jìn)行系統(tǒng)考察，最終建立以下鑒別試驗(yàn)方法。

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品2.5 g，加水50 mL，超聲處理10 min，使之充分溶解，加入50 mL乙酸乙酯溶液進(jìn)行萃取，取乙酸乙酯層濃縮至干，殘?jiān)尤?～2 mL甲醇溶解，作為供試品溶液備用。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取適量人參皂苷Rh1、Rg3，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的混合對(duì)照溶液備用。

2.1.3 鑒別方法 分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5～10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，用不加入熟三七提取物的空白顆粒作為陰性對(duì)照，以三氯甲烷-甲醇-水(8∶2∶0.2)為展開(kāi)劑展開(kāi)，展距為7～8 cm，取出晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，于105 ℃下烘至斑點(diǎn)顯色清楚即可，薄層色譜圖見(jiàn)圖1。

注：1.供試品20131105；2.供試品20131109；3.供試品20131111；4.人參皂苷Rh1、Rg3；5.陰性對(duì)照。圖1 三批熟三七配方顆粒的TLC圖

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積5～10 μL，以乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相洗脫條件

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1，人參皂苷Re、Rd對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含三七皂苷R10.2 mg、人參皂苷Re 0.2 mg、人參皂苷Rd 0.2 mg的混合溶液，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得；精密稱取人參皂苷Rg1、Rb1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg10.5 mg、人參皂苷Rb10.5 mg的混合溶液，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品1.25 g，置25 mL量瓶中，加水溶液適量，超聲處理10 min，使之全部溶解，用水定容至刻度線，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0，15.0，20.0 μL，按2.2.1色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。見(jiàn)表2。結(jié)果表明，本法線性關(guān)系良好，符合含量測(cè)定要求。

表2 線性測(cè)定結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.2中混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖與峰面積，測(cè)定結(jié)果顯示，RSD值都小于2%(n=6)，表明本法精密度良好，符合含量測(cè)定要求。見(jiàn)表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取6份樣品(批號(hào)：20131109)，按2.2.3項(xiàng)下操作，依法測(cè)定，結(jié)果三七總皂苷含量以干燥品計(jì)為6.73%，測(cè)定結(jié)果顯示RSD值都小于2%，表明本法重復(fù)性良好。見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、36 h 各進(jìn)樣10 μL，以5個(gè)指標(biāo)成分的峰面積計(jì)算RSD值。計(jì)算結(jié)果顯示，RSD值均小于2.0%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)：20131111，含三七皂苷R10.49%、人參皂苷Rg13.04%、人參皂苷Re 0.23%、人參皂苷Rb12.20%、人參皂苷Rd 0.44%)適量，各6份，精密稱定，分別置25 mL容量瓶中，分別加入干燥至恒重的三七皂苷R1約3 mg、人參皂苷Rg1約19 mg、Re約1.4 mg、Rb1約13.8 mg、Rd約2.8 mg，依含量測(cè)定項(xiàng)下方法處理，測(cè)定計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)(n=6)

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取10批樣品，按擬定的含量測(cè)定方法操作。結(jié)果表明，本法穩(wěn)定、可行，能對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7，熟三七配方顆粒及對(duì)照品的HPLC圖見(jiàn)圖2。

表7 含量測(cè)定結(jié)果(n=10)

注：A.熟三七配方顆粒；B.對(duì)照品；C.對(duì)照品；1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Rb1；4.人參皂苷Rg1；5.人參皂苷Rb1。圖2 熟三七配方顆粒及對(duì)照品HPLC圖

由表7可知，本品10批樣品含量穩(wěn)定，含量限度按測(cè)定結(jié)果平均值的80%計(jì)算。本品按干燥品計(jì)算，含人參皂苷Rg1(C42H72O14)不得少于2.50%、人參皂苷Rb1(C54H92O23)不得少于1.70%、三七皂苷R1(C47H80O18)不得少于0.40%、人參皂苷Re(C48H82O18)不得少于0.15%、人參皂苷Rd(C48H82O18)不得少于0.30%，且人參皂苷Rb1(C54H92O23)、人參皂苷Rg1(C42H72O14)、三七皂苷R1(C47H80O18)、人參皂苷Re(C48H82O18)、人參皂苷Rd(C48H82O18)的總量不得低于5.00%。

3 討論

3.1中藥配方顆粒突破了傳統(tǒng)中藥飲片需要煎煮的服用模式，具有免煎易服、易儲(chǔ)存、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。但中藥配方顆粒已不具備中藥飲片的外形、性狀及顯微鑒別，因此，建立切實(shí)可行的中藥配方顆粒質(zhì)量分析標(biāo)準(zhǔn)是保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

3.2本文所述熟三七配方顆粒為由符合炮制規(guī)范的熟三七飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒等工序制成的新型飲片。云南省地方標(biāo)準(zhǔn)YPBZ-0193-2013、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)WS-11219(ZD-1219)-2002-2012Z分別收載有熟三七粉(蒸制)、熟三七散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，兩份標(biāo)準(zhǔn)中都有其功能性成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb13個(gè)成分的總量不得低于4.5%的限定。目前，熟三七配方顆粒并無(wú)相關(guān)法定標(biāo)準(zhǔn)。本研究對(duì)熟三七配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究具有一定的參考價(jià)值。

3.3三七經(jīng)蒸制后，部分原生皂苷成分將會(huì)轉(zhuǎn)化成次生皂苷[4]。云南省地方標(biāo)準(zhǔn)YPBZ-0193-2013、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)WS-11219(ZD-1219)-2002-2012Z質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下并未對(duì)降解皂苷進(jìn)行定性或定量分析，本文引入薄層色譜法對(duì)人參皂苷Rh1和Rg3進(jìn)行鑒別，方法準(zhǔn)確簡(jiǎn)便，可有效控制制劑質(zhì)量，彌補(bǔ)上述標(biāo)準(zhǔn)之不足。

3.4由方法學(xué)考察結(jié)果可見(jiàn)，本方法線性關(guān)系良好，重復(fù)性良好。回收率結(jié)果表明，此方法可靠性良好，穩(wěn)定性滿足測(cè)定時(shí)間的要求。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、專屬性好，能有效對(duì)熟三七配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 楊崇仁，崔占和，周俊，等.生三七和熟三七皂苷成分的分離和鑒定[J].中藥通報(bào)，1985，10(9)：417-418.

[3] 余河水，張麗娟，宋新波，等.三七炮制品化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38(22)：3910-3917.

[4] Liao P Y，Wang D，Zhang Y J，et al.Dammarane-type glycosides from the steamed notoginseng[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，2008，56(5)：1751-1756.

[5] 張建眷，王少臣，胡浩，等.中藥顆粒劑研究概況[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與臨床，2005，3(2)：30-31.

[6] 李松林，宋景政，徐宏喜.中藥配方顆粒研究淺析[J].中草藥，2009，40(增刊)：1-7.

StudyonQualityStandardofSteamedNotoginsengFormulaGranules

ZENGShufen1，2，CHENJindong1，2*，RENYangfan1，2，CHENRongjie1，2

Objective：To establish the quality standard for steamed Notoginseng formula granules，and provide a basis for scientific evaluation of its quality.Methods：Ginsenosides Rh1and ginsenoside Rg3in steamed Notoginseng formula granules were identified by TLC，and the contents of notoginsenoside R1，ginsenosides Rg1，Re，Rb1，Rd in steamed Notoginseng formula granules were determined by HPLC.Results：To established a method to identify Panax ginseng saponin Rh1and ginsenoside Rg3in Steamed Notoginseng Formula Granules by TLC；to establish a method to detect the content of Panax notoginsenoside R1，ginsenosides Rg1，Re，Rb1，Rd in Steamed Formula Notoginseng Granules.Conclusion：The established method is simple，accurate，reproducible，and it can be used as a quality control method for steamed Notoginseng formula granules.

Steamed Notoginseng formula granules；HPLC；TLC

(1.YunnanWeihePharmaceuticalsco.，Ltd，YuxiYunnan，653100，China；2.YunnanEngineeringResearchCenterofPlantExtracts，YuxiYunnan，653100，China)

2014-07-02)

*

陳金東，工程師，研究方向：天然藥物分析研究；Tel：(0877)2666733-2101，E-mail：chenjindong_2005@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.7.018