武鳳蓮,朱東來,蔣韜,王連英

A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕組織中TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)的影響

武鳳蓮,朱東來,蔣韜,王連英

(秦皇島市第一醫(yī)院燒傷整形外科河北秦皇島066000)

目的:探討A型肉毒毒素(botulinum toxin A,BTXA)對(duì)增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞中TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響.方法:組織塊法培養(yǎng)增生性瘢痕組織及正常皮膚組織的成纖維細(xì)胞,用不同濃度的BTXA作用于體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞,檢測MTT值;將濃度為0.2U/ml、0.4U/ml、0.8U/mlBTXA作用于增生性瘢痕成纖維細(xì)胞48h,利用RT-PCR檢測BTXA對(duì)TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)量.結(jié)果:BTXA在體外能明顯抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖,隨著藥物濃度的增加及時(shí)間的延長,其抑制作用明顯增強(qiáng),能夠減少TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá),且隨著藥物濃度的增加,TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)量呈下降趨勢.結(jié)論:BTXA通過抑制瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的增殖,減少TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá),減少細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積來影響增生性瘢痕的形成.

A型肉毒毒素;增生性瘢痕;TGF-β1;collagenⅠ

A型肉毒毒素(botulinum toxin type A,BTXA)是由肉毒梭菌產(chǎn)生的一種神經(jīng)毒性藥物,它能夠持久的抑制神經(jīng)肌肉接頭處乙酰膽堿的釋放而使肌肉松弛麻痹,其這一原理已用于治療肌張力障礙及肌肉痙攣性的疾病[1].近來又有研究發(fā)現(xiàn)A型肉毒毒素并不只單純作用于膽堿能神經(jīng)末梢,在平滑肌和腺體亦可以通過抑制膽堿能或非膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用[2].目前有研究用A型肉毒毒素治療瘢痕及抑制瘢痕增生取得了較好的臨床治療效果[3-5].本研究通過BTXA對(duì)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的形態(tài)和增殖變化的影響,以及TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)的影響,為其在瘢痕防治領(lǐng)域里提供理論依據(jù).

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司USA),BTXA(蘭州生物制品研究所),Trizol總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國PROMEGA公司),taq酶購于日本TAKARA;MTT、DMSO購于SIGMAUSA,新生小牛血清(天津TBD公司),光學(xué)顯微鏡,投射電鏡,PCR儀器.

1.2實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

標(biāo)本取自本科室2012-2014年18例增生性瘢痕患者手術(shù)切下的增生性瘢痕組織及正常的皮膚組織,患者年齡14～45歲,平均年齡32歲;病程6個(gè)月～2年,患者3個(gè)月內(nèi)均未經(jīng)過免疫治療,放射線治療及激光治療,取標(biāo)本前均得到患者的知情同意.

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

將增生性瘢痕組織及正常的皮膚組織標(biāo)本在無菌室用含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次后將其剪成0.5mmX0.5mmX 0.5mm～1mmX1mmX1mm大小的小組織塊,接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)方瓶中,在37.0℃、5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2孵箱中靜置培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞的生長情況,每周更換兩到三次培養(yǎng)液,待3周后原代細(xì)胞從組織塊中長出并融合成致密的單層,進(jìn)行傳代,采用0.25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸消化,按1∶4傳代,藥物實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為3～6代.

1.4MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖情況

將對(duì)數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞制成5X106懸浮液,以每孔100μl的成纖維細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中.置于37.0℃、5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2飽和溫度的孵箱中繼續(xù)孵育24h.待細(xì)胞完全貼壁后去除培養(yǎng)液,分別加入含濃度(U/ml)0,0.1,0.2,0.4, 0.8,1.6 BTXA的10%小牛血清的DMEM 200μl,培養(yǎng)液每組設(shè)6個(gè)平行孔及空白對(duì)照孔,加藥繼續(xù)孵育48h后,每孔加MTT(5mg/ml)20μl繼續(xù)孵育3h后,棄掉上清液,每孔加200μl DMSO振蕩混勻,用自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀在設(shè)定波長492nm時(shí)測定其OD值.計(jì)算藥物的抑制率(IR):

IR=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)X100%

1.5總RAN的提取

將濃度為0.2 U/ml、0.4 U/ml、0.8 U/ml的BXTA加入含有1X106個(gè)/ml第3～6代細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中,孵育48h,收獲細(xì)胞.采用TRizol Reagent總RNA抽提試劑盒,操作步驟按試劑盒的操作指南進(jìn)行.并電泳鑒定提取RNA的完整性.經(jīng)檢測所有樣本260/ 280nm比值均大于1.8,提示樣品純度較高,-80℃儲(chǔ)存.

1.6MT-RT-PCR

TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白和β-actin基因表達(dá)的變化采用半定量RT-PCR方法.首先用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A3500),按說明書操作指南進(jìn)行cDNA的合成.MT-RT-PCR反應(yīng)體系為25μl,構(gòu)成如下:10Xbuffer 2.5μl,dNTP 2μl,模板4ug,特異性引物上下游各1μl,β-actin上下游引物各1μl,Taq酶2.5U,加水至總反應(yīng)體積25μl.擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5min,95℃變性30S,退火溫度見表1,72℃延伸1min,40個(gè)循環(huán),最后72℃再延伸10min終止反應(yīng).

1.7PCR產(chǎn)物分析

取10μl PCR產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,用凝膠掃描成像分析儀處理系統(tǒng)掃描各條帶紫外光吸收量(Vol).目的基因Vol值與相應(yīng)內(nèi)參βactin Vol值的比值代表每個(gè)樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物mRNA的相對(duì)表達(dá)量,測定并比較增生性瘢痕與正常皮膚,以及加入肉毒毒素作用后增生性瘢痕成纖維細(xì)胞TGF-β1及Ⅰ膠原蛋白基因的表達(dá)的變化.

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPPS13.0軟件,用t檢驗(yàn)法,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1BTXA對(duì)增生瘢痕成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響

光鏡下可見對(duì)照組成纖維細(xì)胞鋪滿視野,梭形細(xì)胞間緊密接觸,加濃度為0.2 U/ml BTXA培養(yǎng)液處理48h后,光鏡下可見細(xì)胞體積開始縮小、變短,樹突狀突起回縮細(xì)胞間隙逐漸增大;當(dāng)濃度達(dá)0.4 U/ml時(shí),細(xì)胞體積縮小明顯;BTXA濃度達(dá)到0.8 U/ml時(shí)細(xì)胞體積縮小更加明顯,形態(tài)變圓,部分細(xì)胞從瓶底脫壁漂浮.投射電鏡下可見對(duì)照組成纖細(xì)胞核較大并且核仁明顯,細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器正常,細(xì)胞膜完整.加BTXA處理后可見部分細(xì)胞的胞膜皺縮,細(xì)胞內(nèi)可見空泡,細(xì)胞核不規(guī)則,染色質(zhì)濃縮,可見凋亡小體,細(xì)胞呈早期凋亡狀態(tài).隨著藥物濃度的增加,鏡下可見到部分凋亡晚期、細(xì)胞核固縮機(jī)壞死的成纖維細(xì)胞.

2.2BTXA對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響

增生性瘢痕成纖維細(xì)胞加入濃度0.1～1.6 U/ml的A型肉毒毒素的細(xì)胞培養(yǎng)液48h、72h后,用MTT法檢測細(xì)胞增殖的變化.結(jié)果顯示,同一觀察時(shí)間,隨著BTXA濃度的增大,成纖維細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制;且同一藥物濃度作用后,隨著時(shí)間的延長,其抑制率顯著增高,見表2.

2.3正常皮膚與增生性瘢痕成纖維細(xì)胞TGF-β1、Ⅰ型膠原的表達(dá)

增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白的相對(duì)表達(dá)量與正常皮膚的表達(dá)相比呈顯著升高趨勢,有顯著性意義(P<0.01)見表3.

2.4BTXA對(duì)增生性瘢痕TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)的影響

對(duì)用濃度分別為0.2 U/ml、0.4 U/ml、0.8 U/ml BTXA的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h的成纖維細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR, TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯下降,隨著藥物濃度的增加,TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)呈下降趨勢,有顯著性意義(P<0.05);高濃度組(0.8 U/ml)與低濃度組(0.2 U/ml)相比較,TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)明顯下降,有顯著性意義(P<0.01)見表4.

表1　用primer5.0輔助設(shè)計(jì)引物

表2　不同濃度BTXA對(duì)細(xì)胞抑制率隨時(shí)間變化情況比較(±s,n=6)

表2　不同濃度BTXA對(duì)細(xì)胞抑制率隨時(shí)間變化情況比較(±s,n=6)

注:對(duì)照組與各濃度組比較P<0.001,不同時(shí)間組比較P<0.05

濃度(U/ml)抑制率(%) 48h(a)72h(b) 0(對(duì)照)00 0.15.34±0.02817.94±0.0156 0.214.51±0.01318.93±0.0102 0.425.65±0.04145.35±0.0287 0.850.42±0.02470.05±0.0231 1.670.01±0.02183.48±0.0257 BTXA

表3　TGF-β1和Ⅰ型膠原mRNA在增生性瘢痕和正常皮膚中的表達(dá)

表4　各組增生性瘢痕TGF-β1和Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)

3　討論

增生性瘢痕是皮膚軟組織創(chuàng)傷、深度燒傷后皮膚軟組織病理性修復(fù)的結(jié)果,輕者影響美觀,重者可致器官的功能障礙,給患者帶來極大的心理創(chuàng)傷,嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量.因此探索增生性瘢痕的形成機(jī)制及尋找有效的理想的防治方法成為迫切而艱巨的任務(wù).增生性瘢痕是病變部位以膠原等細(xì)胞外基質(zhì)過度產(chǎn)生和沉積為病理學(xué)特征的疾病,其中來源于成纖維細(xì)胞的Ⅰ型膠原蛋白所占的比例較大,以Ⅰ型膠原蛋白的過度沉積為主要特征[6].隨著細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的快速發(fā)展,成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是增生性瘢痕形成過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞,其能夠合成并分泌膠原基質(zhì),促進(jìn)創(chuàng)面的愈合.當(dāng)成纖維細(xì)胞增殖,持續(xù)過度分泌膠原蛋白則會(huì)產(chǎn)生大量的Ⅰ型膠原蛋白,并異常沉積于創(chuàng)面最終形成增生性瘢痕.成纖維細(xì)胞在增生性瘢痕的形成過程中,會(huì)受細(xì)胞因子、低氧、免疫因素、神經(jīng)肽物質(zhì)等到多種因素的作用后發(fā)揮其效應(yīng).其中TGF-β1是目前在已知的細(xì)胞因子中促進(jìn)瘢痕形成的最重要的細(xì)胞因子[7-8].TGF-β1是一種具有多種生理功能的多肽,能導(dǎo)致組織纖維化,也能誘導(dǎo)肉芽組織中成纖維細(xì)胞表達(dá)高水基質(zhì)蛋白[9].在創(chuàng)面愈合早期,除了TGF-β1,會(huì)有其他因子參與瘢痕的形成,在中后期,TGF-β1成為瘢痕形成的主要因素,其通過自身誘導(dǎo)功能和誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)沉積的功能,提高整合素的表達(dá),通過改變其細(xì)胞膜上的相對(duì)比例,增大對(duì)基質(zhì)的粘附促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù);是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)趨化因子,可通過旁分泌及自分泌直接或間接、單獨(dú)或協(xié)同作用與炎癥并修復(fù)細(xì)胞,產(chǎn)生細(xì)胞的趨化性遷移,增殖分化;TGF-β1也可以直接作用于成纖維細(xì)胞,促進(jìn)基質(zhì)蛋白的合成.同時(shí)TGF-β1是Ⅰ型膠原蛋白的強(qiáng)有效多基因代碼誘導(dǎo)劑[10].TGF-β1與細(xì)胞表面特異性的受體結(jié)合后使調(diào)節(jié)蛋白的絲氨酸和蘇氨酸堿基磷酸化,從而激活Ⅰ型膠原啟動(dòng)基因的表達(dá)[7],刺激Ⅰ型膠原的合成分泌,引起細(xì)胞內(nèi)外Ⅰ型膠原的明顯積聚,最終導(dǎo)致創(chuàng)面成纖維細(xì)胞膠原合成異常.故TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白在創(chuàng)面愈合時(shí)增生性瘢痕形成過程中處于至關(guān)重要的中心樞紐作用.如何干擾TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白在增生性瘢痕形成中作用,成為防治增生性瘢痕的重點(diǎn).

目前,臨床應(yīng)用A型肉毒毒素治療增生性瘢痕,可以抑制瘢痕的增生攣縮,減輕疼癢癥狀,并且能夠使瘢痕萎縮變平[11].但其具體機(jī)制尚不清楚.本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng),瘢痕組與對(duì)照組比較,增生性瘢痕中的TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),進(jìn)一步說明兩者是增生性瘢痕形成的重要因素.本實(shí)驗(yàn)用MTT比色法證明BTXA在體外能夠明顯抑制瘢痕的成纖維細(xì)胞的增殖(P<0.001),且具有藥物濃度的依賴性,及藥物作用時(shí)間點(diǎn)不同的依從性.本實(shí)驗(yàn)分別用濃度分別為0.2 U/ml、0.4 U/ml、0.8 U/ml BXTA的培養(yǎng)液培養(yǎng)成纖維細(xì)胞48h,與對(duì)照組比較,TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白的mRNA的表達(dá)下降(P<0.05),高濃度組BTXA(0.8 U/ml)與低濃度組BTXA(0.2 U/ml)比較,TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.01),具有藥物的濃度的依賴性.以上結(jié)論說明BTXA能夠抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中TGF-β1和Ⅰ型膠原蛋白的mRNA表達(dá),減慢增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖,并且使成纖維細(xì)胞減少大量膠原的合成,減輕組織的纖維化,進(jìn)而減輕瘢痕的增生.本研究為BTXA在臨床上治療及預(yù)防增生性瘢痕提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),但其治療及預(yù)防增生性瘢痕時(shí),其作用的具體靶點(diǎn)、環(huán)節(jié)及確切機(jī)制仍需要更深層次及大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí).

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編輯/張惠娟

Study on BTXA on the expression of TGF-β1 and collagenⅠin hypertrophic scar

WU Feng-lian,ZHU Dong-lai,JIANG Tao,WANG Lian-ying
(Department of Burn and Plastic Surgery,The First Hospital of Qinhuangdao,Qinhuangdao 066000, Hebei,China)

ObjectiveTo investigate the effect of botulinum toxin A(BTXA)on the expression of TGF-β1 and collagenⅠin hypertrophic scar fibroblast.Methods After treated with different concertrations of BTXA,the inhibition rate of hypertrophic scar fibroblasts were detected by MTT assay,0.2U/ml,0.4 U/ml and 0.8U/ml of BTXA was added in cultured hypertrophic scar fibroblast for 48h,the expression of TGF-β1and collagenⅠin hypertrophic scar fibroblasts was respectively detected with RT-PCR.Results BTXA can significantly inhibit the proliferation of hypertrophic scar fibroblast,and the expression of TGF-β1and collagenⅠcould be inhibited significantly,the levels of the proliferation of hypertrophic scar fibro?blast and the expression of TGF-β1and collagenⅠdecreased along with the increase in BTXA concer?tration.Conclusion BTXA inhibits hypertrophic scar formation through inhibiting the proliferation of hy?pertrophic scar fibroblast and down-regulating the expression of TGF-β1 and collagenⅠ.

botulinum toxin A;hypertrophic scar;TGF-β1;collagenⅠ

Q813.1

A

1008-6455(2015)07-0040-04

王連英,主任醫(yī)師,河北省秦皇島市,秦皇島市第一醫(yī)院,燒傷整形外科,郵編:066000

2015-03-06

2015-04-13