陳麗娟,徐姣,谷建梅,徐艷明,祁永華,王業(yè)秋,張寧

.基礎(chǔ)研究.

十精丸中菊花、枸杞養(yǎng)肝藥對組合抗皮膚光老化作用的研究

陳麗娟,徐姣,谷建梅,徐艷明,祁永華,王業(yè)秋,張寧

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院黑龍江佳木斯154007)

目的:探討十精丸中菊花、枸杞養(yǎng)肝藥對組合抗皮膚光老化的作用及機制.方法:觀察菊花、枸杞養(yǎng)肝藥對組合對紫外線照射大鼠皮膚和血清中抗氧化酶系活力及羥脯氨酸含量的影響.結(jié)果:菊花、枸杞養(yǎng)肝藥對高、中、低劑量組皮膚及血清中抗氧化酶系活力及羥脯氨酸含量高于模型對照組,尤以高劑量組明顯.結(jié)論:十精丸中菊花、枸杞養(yǎng)肝藥對組合能夠改善皮膚光老化狀態(tài),具有抗皮膚光老化的作用.

十精丸;菊花;枸杞;光老化;氧化應(yīng)激

紫外線照射后產(chǎn)生的氧自由基損傷是導(dǎo)致皮膚光老化的重要原因,當(dāng)前空氣污染日益嚴(yán)重,天然紫外線透入量日益增加,皮膚光化損害現(xiàn)象也日益嚴(yán)重.由紫外線引起皮膚老化的發(fā)生機制十分復(fù)雜.目前國內(nèi)外對其研究尚未得出明確結(jié)論,因此,選用行之有效的經(jīng)典方劑進行綜合調(diào)理,是十分必要的.

十精丸出自明代《普濟方.諸虛門》,是中醫(yī)美容保健,延年益壽之傳統(tǒng)名方[1].有"溫腎滋腎,益精填髓,養(yǎng)心益智,平肝明目,烏須發(fā),悅?cè)蓊?的作用.本課題組以十精丸中菊花、枸杞藥對組合為研究對象,探討?zhàn)B肝中藥在皮膚光老化防治中的作用.

1　材料

1.1受試藥物

菊花、枸杞(十精丸中養(yǎng)肝藥對).購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院附屬醫(yī)院中藥局.

1.2陽性對照藥

三精維生素E由哈藥集團三精醫(yī)藥商貿(mào)有限公司生產(chǎn),批號:20140401.

1.3儀器

紫外照射儀(Sigma公司),紫外線輻照計(北京師范大學(xué)光電儀器廠),ResecarchUVUF型超純水制備系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司),MS-500A半自動生化分析儀(美生科技有限公司),TGL-16G-C型高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠),DY89-I電動玻璃勻漿機(上海民儀電子有限公司).

1.4試劑

羥脯氨酸(HYP)試劑盒產(chǎn)品批號:20141006南京建成生物工程研究所;SOD測定試劑盒產(chǎn)品批號:20141006南京建成生物工程研究所;MDA測定試劑盒產(chǎn)品批號:20141006南京建成生物工程研究所;GSH-Px試劑盒產(chǎn)品批號:20141006南京建成生物工程研究所;CAT試劑盒產(chǎn)品批號:20141006南京建成生物工程研究所;H2O2測定試劑盒產(chǎn)品批號:20141006南京建成生物工程研究所;乙醇、無水乙醇、二甲苯、蘇木精、硫酸鋁鉀、蒸餾水、0.5%伊紅、鹽酸等均為市售分析試劑.

2　方法

2.1光老化模型建立及分組

wistar(14～16月齡)大鼠60只,雌雄各半,體重(280±20)g,佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供.適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機分成6組,每組10只,即空白對照組(control groupctl)、模型組(model bank, MB)、菊花、枸杞養(yǎng)肝藥對低、中、高組(D、Z、G)、陽性對照組(Positive control group,PCG).

各組大鼠背部剃毛,空白對照組只剃毛不照射.根據(jù)測得的最小紅斑面積(MED),UVA照射劑量每次約為29J/cm2,UVB約為64.mJ/cm2,用紫外線測量儀來測量.每次照射時間為1h,2周后,每次照射時間增加為2h.

2.2藥物制備

本課題組前期研究已確定了十精丸美容作用的最佳劑量[2],本研究在最優(yōu)劑量基礎(chǔ)上,按中醫(yī)學(xué)方劑配伍理論將十精丸菊花、枸杞養(yǎng)肝藥對按原有劑量水煎.置4℃冰箱保存,灌胃給藥,使用前水浴至30℃,實驗周期6周.

2.3標(biāo)本制備

2.3.1血清制備:于最后一次給藥后,禁食不禁水12h,烏拉坦腹腔注射麻醉后,門靜脈采血3～5ml,以3 000r/ min,低溫離心15min,吸取血清0.5ml于滅菌離心管中. 2.3.2皮膚組織勻漿的制備:①每只大鼠在背部剪取約1cmX1cm大小的皮膚組織,在預(yù)冷生理鹽水中漂洗3次,除去血液,用濾紙拭干,用眼科剪刀剪碎組織塊,將剪碎的組織倒入剝離勻漿管中;②量取4ml預(yù)冷生理鹽水,倒入勻漿器中進行充分勻漿(冰水浴中進行);③將勻漿液以4 000r/min的速度低溫離心l5min;④取上清液備用.

2.4皮膚組織病理學(xué)檢測取材

于大鼠背部正中,剪取1cmX1cm皮膚,去處脂肪,預(yù)冷生理鹽水清洗3遍,以10%甲醛固定待檢;

2.5光鏡標(biāo)本檢查

將經(jīng)4%多聚甲醛固定24h以上的各組大鼠皮膚、卵巢標(biāo)本,經(jīng)酒精梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,常規(guī)切片(5μm),HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察.

表1　各組大鼠血清氧化應(yīng)激水平結(jié)果

表2　大鼠皮膚組織中膠原與抗氧化酶測定結(jié)果

2.6統(tǒng)計學(xué)處理

圖1　菊花、枸杞藥物組高劑量組(光鏡下200X)

圖2　菊花、枸杞藥物組低劑量組(光鏡下200X)

圖3　陽性對照組(光鏡下200X)

圖4　空白對照組(光鏡下200X)

計量資料以x±s表示,數(shù)據(jù)處理全部采用t檢驗,P<0.05差異顯著.

3　實驗結(jié)果

3.1大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)測定結(jié)果

各給藥組血清抗氧化酶系明顯高于模型組,高、中劑量組與空白對照組、模型組相比差異極顯著(P<0.01)有統(tǒng)計學(xué)意義,低劑量組與空白對照組、模型組相比差異較為顯著(P<0.05).結(jié)果表明十精丸中菊花、枸杞養(yǎng)肝藥對能不同程度地提高受試大鼠血清抗氧化酶水平,減少MDA含量,提示其具有提高機體整體抗氧化功能、修復(fù)皮膚光損傷、改善皮膚光老化的作用.

各給藥組皮膚組織中抗氧化酶水平和膠原含量明顯高于模型組,高、中劑量組與空白對照組、模型組相比差異極顯著(P<0.01)有統(tǒng)計學(xué)意義,低劑量組與空白對照組、模型組相比差異較為顯著(P<0.05).結(jié)果表明十精丸中養(yǎng)肝藥對能不同程度地提高受試大鼠皮膚組織中抗氧化酶水平,減少MDA含量并提高膠原含量,提示十精丸中的養(yǎng)肝藥對在皮膚局部也具有提高抗氧化功能、減輕輻射損害,修復(fù)皮膚光損傷的作用.

3.2組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

各組大鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察(光鏡200X)見各圖1～4.

菊花、枸杞藥對(圖1、圖2):以高劑量改變明顯,表皮角化層變薄,基底層色素沉著明顯減輕;真皮層變厚,膠原纖維致密豐富,腺管擴張,分泌旺盛.

陽性藥對照組(圖3):表皮角化層較厚,基底層色素沉著明顯,真皮膠元纖維細(xì)胞稍多,汗腺、皮脂腺變化不明顯.

空白對照組(圖4):表皮角化層厚,基底層色素沉著明顯,真皮層膠元纖維細(xì)胞稀疏,有玻璃樣變,皮脂腺汗腺腺管無顯著改變.

4　討論

目前預(yù)防和治療皮膚光老化的措施,多集中使用防曬化妝品、口服或外用抗氧化劑等方面.但是,現(xiàn)在所使用的這些抗氧化劑有的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,有的則需要較高濃度才能起作用,因此有必要尋找開發(fā)新的高效抗氧化劑,以增強抗光損傷的功效,達到預(yù)防皮膚光老化的目的.中藥美容、延緩皮膚衰老的歷史悠久、療效可靠、安全性高,應(yīng)充分發(fā)掘其在這方面的潛力和優(yōu)勢.

在中藥或天然植物中尋找高效安全的自由基清除劑的研究,是當(dāng)前醫(yī)藥學(xué)和日用化學(xué)品科學(xué)中一個十分熱門的研究方向[3-4].

肝與面部肌膚狀態(tài)關(guān)系極為密切.肝主疏泄,司血海,與腎、脾等-參與氣血的生成、統(tǒng)攝與運行,調(diào)節(jié)諸臟腑功能,使氣血充盛調(diào)和,上榮于頭面,以滋養(yǎng)面部肌膚,因此面色反映氣血之變,也可察知肝之功能,故謂肝其華在面[5].肝為氣機升降之樞,全身氣血津液運行主要取決于肝[6],肝的功能正常,脾運健旺,化源充沛,氣血運行流暢則可延年悅面、抗衰駐顏.

紫外線照射可直接導(dǎo)致DNA的光激發(fā),并且活性氧族和氧自由基損傷皮膚已經(jīng)被廣泛的認(rèn)為是紫外線產(chǎn)生光毒性的機制之一[7-9].

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)可解除脂類和過氧化物的毒性.從而提高了皮膚組織清除自由基與抗氧化的能力,同時也降低了對細(xì)胞組織的氧化性損傷,這對改善衰老皮膚細(xì)胞功能活性、提高皮膚防護能力、延緩皮膚衰老具有積極的意義.皮膚中的羥脯氨酸含量穩(wěn)定,其含量可以直接反應(yīng)出真皮內(nèi)膠原纖維的含量變化.所以其含量變化可以作為判定皮膚老化程度的一個敏感的指標(biāo)[10].綜合本研究中各組比較結(jié)果及皮膚組織病理圖片表明,十精丸中養(yǎng)肝藥對能不同程度地提高受試大鼠皮膚組織中抗氧化酶水平,減少MDA含量,提高膠原含量,提示十精丸中養(yǎng)肝藥對在皮膚局部也具有提高抗氧化功能、減輕輻射損害,改善并修復(fù)皮膚光老化損傷的作用.

[1]明.朱橚.普劑方[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1983:185-226.

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[4]馬卓飛,鄭瑩,林艷明.中草藥防治皮膚光老化機制研究現(xiàn)狀[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,14(1):209-211.

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編輯/張惠娟

Study on the effect of light aging resistance of chrysanthemum and chinese wolfberry in shijingwan

CHEN Li-juan,XU Jiao,GU Jian-mei,XU Yan-ming,QI Yong-hua,WANG Ye-qiu,ZHANG Ning
(Jiamusi College,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China)

Objective To investigate the Lycium chrysanthemum medicine on skin anti light aging pro?tection mechanism.Methods To observe the effect of anti oxidative enzymes activity,hydroxyproline content in skin and serum of rat Lycium chrysanthemum of UV irradiation in.Results Lycium chrysan?themum to the senior high school group,low dose in skin and serum antioxidase activity,hydroxyproline content was higher than that of the model control group,especially in the high dose group.Conclusion Lycium chrysanthemum can improve the state of skin photoaging with anti photoaging skin old role.

Shijingwan;Chrysanthemum;Chinese wolfberry;Light aging;oxidative stress

R285.5

A

1008-6455(2015)07-0037-03

1.黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究(面上)項目"十精丸抗ESF-1細(xì)胞光老化的作用機制研究"(項目編號:12531630);黑龍江省自然科學(xué)基金面上項目"十精丸抗皮膚光老化作用及對關(guān)鍵因子影響的研究"(項目編號:D201231);黑龍江省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科研項目"十精丸抗皮膚光老化及相關(guān)細(xì)胞因子作用機理的研究"(項目編號:ZHY12-Z066)

徐姣,女,碩士研究生,主要從事美容化妝品配方設(shè)計的教學(xué)與研究工作;E-mail:xujiao2007@sina.com

2015-03-05

2015-04-17