沈 峰，陳建能，鄭瑞丹，王曉穎，潘 勤，陳光榆，章瑞南，徐雷鳴，范建高

非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確病因以外的因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床綜合征。其疾病譜包括單純性脂肪肝（Simple fatty liver，SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及其相關(guān)肝纖維化或者肝硬化，嚴(yán)重時(shí)可進(jìn)展為肝癌。隨著肥胖和代謝綜合征的全球化流行趨勢(shì)，NAFLD已成為當(dāng)今發(fā)達(dá)國(guó)家和中國(guó)富裕地區(qū)慢性肝病的首要病因[1]。腸道含有人體最大的貯菌庫(kù)及內(nèi)毒素池，其微生物總量達(dá)到10～100萬(wàn)億，總質(zhì)量約1000克，其基因組更是人體細(xì)胞基因組的150多倍[2]。早在80年前Hoefert首次描述了慢性肝病患者腸道菌群種類(lèi)的改變，揭示了腸道菌群在“肝-腸循環(huán)”中所起的重要作用。腸源性物質(zhì)通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)入體內(nèi)，肝臟作為門(mén)靜脈的首過(guò)器官，與腸道微生態(tài)不僅在解剖上，而且在功能上都有著密切的聯(lián)系[3]。近年來(lái)研究顯示，腸道菌群失衡在SFL、NASH及其相關(guān)纖維化或肝硬化進(jìn)程中發(fā)揮著非常重要的作用。隨著高通量測(cè)序技術(shù)及人體腸道菌群宏基因組學(xué)研究的進(jìn)展，肥胖相關(guān)的腸道菌群結(jié)構(gòu)特征已逐漸清晰[4]，而與肥胖相關(guān)的NAFLD患者腸道菌群組成尚不明確。本研究采用454測(cè)序技術(shù)，對(duì)NAFLD患者腸道菌群結(jié)構(gòu)改變的生物學(xué)特征進(jìn)行了初步分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2012年7月至2012年12月在新華醫(yī)院消化內(nèi)科進(jìn)行“肝活檢”確診的成年（>18周歲）NAFLD患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南2010年修訂版》[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：過(guò)渡飲酒（折合乙醇量大于>140 g/w，女性>70 g/w）、病毒性肝炎（如慢性乙型或丙型肝炎）、藥物性肝損傷、全胃腸外營(yíng)養(yǎng)、HIV感染、自身免疫性肝炎等疾病。同期招募健康體檢者作為正常對(duì)照組，完成受控衰減參數(shù)（Controlled attenuation parameter，CAP） 檢 查 ，以CAP<215 dB/m為依據(jù)排除肝脂肪變（超過(guò)5%）[6]。排除健康人有過(guò)渡飲酒、糖尿病、高血壓及高脂血癥等病史。所有研究對(duì)象在入組前2月內(nèi)停止使用抗生素、微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、酸奶、胃腸道動(dòng)力藥物及其他可影響腸道菌群的藥物。入組當(dāng)天空腹完成身高、體質(zhì)量、腰圍等測(cè)量，留取肘靜脈血5 ml，置-20℃冰箱保存，備血清學(xué)測(cè)定。本研究方案經(jīng)新華醫(yī)院倫理委員會(huì)備案，所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2 肝活檢 使用MaxCore一次性肝活檢穿刺針（18G，美國(guó)BARD生物系統(tǒng)公司），在B超引導(dǎo)下行肝活檢術(shù)。肝組織長(zhǎng)度＞1.6 cm，每份標(biāo)本的匯管區(qū)數(shù)≥6個(gè)。將肝組織條立即置于4%中性甲醛溶液中固定，采用改良法脫水、包埋、切片，分別行蘇木素-伊紅、Masson三色及網(wǎng)狀纖維染色，由同一名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師閱片。參照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院關(guān)于NASH臨床研究網(wǎng)提供的病理工作組指南，進(jìn)行NAFLD活動(dòng)度積分（NAFLD activity score，NAS）和纖維化分期評(píng)定[7]。NAS包括肝脂肪變（0～3）、小葉內(nèi)炎癥（0～3）及肝細(xì)胞氣球樣變性（0～2），總分為8分。NAS>4分，確診NASH；脂肪含量分為S0（<5%）、S1（5%～33%）、S2（34%～66%） 和 S3（>66%）。

1.3 糞便總DNA抽提 采集晨起新鮮糞便約1～2 g，立即置于無(wú)菌采樣盒內(nèi)，-80℃低溫冷凍保存。取200 mg冰凍樣品，采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）快速提取和純化DNA，在完成濃度測(cè)定及瓊脂糖凝膠電泳評(píng)定后，保存于-20℃冰箱。

1.4 16S DNA V3～V5測(cè)序 采用聚合酶鏈反應(yīng)和焦磷酸測(cè)序法，使用16 s V3～V5區(qū)通用引物926 F（5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’） 和 338 R （5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），在 5’末端，采用Roche/454特異性接頭和（或）多重標(biāo)簽（multiplex identifier，MID）修飾，其PCR產(chǎn)物覆蓋V3～V5可變區(qū)。配置反應(yīng)體系50μL，每個(gè)反應(yīng)體系包括PFX DNA 聚合酶（250U）0.8 μL，10×PFX 緩沖液（Mg2+）5 μL，dNTP 混合物（各 10 mM）2 μL、引物 6 μL（各 10 μM），DNA 模板（20 ng）1 μL 和三蒸水 35.2 μL，共50μL。采用AXYGEN磁珠法純化PCR產(chǎn)物，PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2 min，然后，在95°C條件下變性 20 s，50°C 退火 30 s，72°C 延伸 30 s，擴(kuò)增 30個(gè)循環(huán)。使用Roche 454 GS FLX系統(tǒng)（深圳華大基因公司）和焦磷酸測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Mothur軟件（Version 1.31.2）在97%序列相似度下將非冗余的讀長(zhǎng)（Reads）進(jìn)行物種注釋?zhuān)⒕垲?lèi)成可操作分類(lèi)單元（Operation taxonomy unit，OTU），在每個(gè)OTU內(nèi)51%以上reads的注釋結(jié)果為該OTU的分類(lèi)[8]。應(yīng)用QIIME（Version 1.50，http://qiime.org/index.html）軟件，計(jì)算樣品Alpha多樣性相應(yīng)Shannon指數(shù)稀釋曲線(xiàn)。應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)其余數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（）表示，各組之間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，各組之間的比較采用x2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般特征 本研究共納入經(jīng)“肝活檢”證實(shí)的NAFLD患者47例，男性35例，女性12例；年齡（37.7±11.9）歲）。健康人34例，男性27例，女性7例；年齡（40.0±8.0）歲。兩組在性別和年齡方面無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。NAFLD患者伴有糖尿病5例（10.6%）、高血壓6例（12.8%）。肝組織學(xué)脂肪變性診斷S1 24例（51.1%）、S2 19例（40.4%）、S3 4例（8.5%）；NASH 25例（53.2%）；輕度纖維化27例（57.4%）、中度纖維化4例（14.8%）、重度纖維化3例（6.4%）。NAFLD患者體質(zhì)指數(shù)（Body mass index，BMI）、腰圍、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯和低密度脂肪蛋白-膽固醇等顯著高于健康人（表1，P＜0.01）。

表1 非酒精性脂肪性肝病與健康人一般資料（）比較

表1 非酒精性脂肪性肝病與健康人一般資料（）比較

非酒精性脂肪性肝?。╪=47）健康人（n=34） P體質(zhì)指數(shù)（kg/m2） 27.6±3.1 21.7±1.7<0.001腰圍（cm） 94.8±7.3 81.9±7.1<0.001空腹血糖（mmol/L） 5.8±2.6 5.5±0.6 0.522 ALT（U/L） 45.4±28.9 17.6±6.5<0.001 AST（U/L） 30.3±19.3 19.5±6.6<0.001總膽固醇（mmol/L） 5.0±1.0 4.6±0.7 0.06甘油三酯（mmol/L） 2.1±1.4 0.9±0.7<0.001高密度脂蛋白-膽固醇（mmol/L） 1.3±0.3 1.4±0.2 0.146低密度脂蛋白膽固醇（mmol/L） 2.9±0.7 2.4±0.5 0.001

2.2 腸道菌群多樣性比較 兩組人群均完成了測(cè)序。在排除與已知序列相似度小于75%的序列后，平均每個(gè)樣本獲得3784條序列。通過(guò)序列比對(duì)及進(jìn)行距離矩陣計(jì)算后，在97%（即種）水平上進(jìn)行OTU劃分，提示47例 NAFLD患者OUTs為（88.3±28.3），顯著低于34例健康人（109.7±30.7）。通過(guò)Shannon指數(shù)分析群落的豐度和多樣性，結(jié)果顯示NAFLD患者腸道菌群多樣性相對(duì)于健康人顯著減少。

2.3 物種組成分析 在“門(mén)（Phylum）”的水平，NAFLD患者厚壁菌門(mén)（Firmicutes）所占比例為（51.2±17.8）%，顯著高于健康人的[（46.4±12.8）%，P=0.048]，而擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）在 NAFLD 組為（31.6±18.9）%，顯著低于健康人的[（43.3±14.4）%，P<0.001，圖 1]；在“綱（Class）”的水平上，NAFLD 組厚壁菌門(mén)中 Erysipelotrich i綱占（3.2±5.1）%，顯著高于健康人的[（1.0±1.2）%，P=0.009]，而擬桿菌門(mén)中 Bacteroidia綱占（31.0±18.8）%，顯著低于對(duì)照組的[（42.3±14.0）%，P=0.004，圖 2]；在“屬（Genus）”的水平上，NAFLD 組乳球菌（Lactococcus）占（0.0038±0.0001）%，低于健康組的[（0.0145±0.001）%，P=0.003，圖 3A]；NAFLD患者普氏菌屬（Prevotella）同樣也顯著減少（P=0.022，圖 3B），而鏈球菌（Streptococcus）在NAFLD占（1.50±0.03）%，顯著高于對(duì)照組[（0.21±0.24）%，P=0.004，圖 3B]。

3 討論

在SFL、NASH及相關(guān)肝纖維化或肝硬化發(fā)病中涉及腸道菌群的變化，但過(guò)去限于技術(shù)條件的限制，對(duì)于NAFLD患者腸道菌群的變化仍然知之甚少。近年來(lái)，隨著技術(shù)手段的進(jìn)步，研究腸道微生物的方法已經(jīng)從早期的細(xì)菌分離培養(yǎng)和基于16S基因的PCR-DGGE、RFLP、16S芯片和16S克隆文庫(kù)測(cè)序等，逐漸發(fā)展到16S高通量測(cè)序和宏基因組測(cè)序，從全基因組水平來(lái)分析腸道菌群的構(gòu)成已成為可能。因此，對(duì)于NAFLD患者而言，從腸道菌群的總體構(gòu)成以及尋找某種特殊的菌種，可以為理解NAFLD/NASH的發(fā)病以及從源頭上解決熱量過(guò)剩等提供理論支持。本研究納入47例經(jīng)“肝活檢”確診的NAFLD患者和34例健康人，對(duì)新鮮糞便進(jìn)行了454測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAFLD腸道內(nèi)定植菌群發(fā)生了顯著變化。通過(guò)OTUs比較，發(fā)現(xiàn)NAFLD患者腸道菌群多樣性明顯減少，其菌種結(jié)構(gòu)改變是NAFLD發(fā)病的誘因還是結(jié)果，還需要研究。

超重或肥胖是人類(lèi)NAFLD的主要危險(xiǎn)因素。微生物學(xué)研究通過(guò)對(duì)肥胖或消瘦人群腸道微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)菌群比例存在一定的差異[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道菌群中90%以上由擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)組成，兩者比例的改變可能影響能量的吸收。例如，與同窩出生的瘦ob/ob小鼠比，肥胖小鼠腸道中厚壁菌門(mén)菌群數(shù)量較擬桿菌門(mén)顯著增加，而對(duì)無(wú)菌小鼠灌注來(lái)自于肥胖小鼠的腸道微生物2周后，則能量吸收效率顯著加強(qiáng)，并且體質(zhì)量也增加[10]。本研究通過(guò)OTUs比較，發(fā)現(xiàn)NAFLD組腸道菌群多樣性明顯減少。對(duì)系統(tǒng)發(fā)育分析提示，NAFLD組厚壁菌門(mén)所占比例顯著增加而擬桿菌門(mén)則顯著減少，與既往研究結(jié)果類(lèi)似。進(jìn)一步在綱的水平上探究該兩門(mén)中細(xì)菌的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康人比，擬桿菌門(mén)水平上的差異主要由Bacteroidia綱導(dǎo)致，而厚壁菌門(mén)的差異主要由Erysipelotrichi綱導(dǎo)致的。也有不少研究表明在2型糖

圖1 NAFLD患者與健康人（Control）腸道細(xì)菌在門(mén)（Phylum）水平的菌群差異比較（以百分比表示） NAFLD患者厚壁菌門(mén)（Firmicutes）所占比例顯著高于健康人，而擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）則低于健康人

圖2 NAFLD與健康人（Control）在綱（Class）水平菌群差異比較（以百分比表示） NAFLD組中Erysipelotrichi綱顯著高于健康人，而B(niǎo)acteroidia綱低于健康人

圖3 NAFLD與健康人（Control）在屬（Genus）水平菌群差異比較（以百分比表示） NAFLD組乳球菌（Lactococcus）和普氏菌屬（Prevotella）比例顯著低于健康人，而鏈球菌（Streptococcus）則顯著高于對(duì)照組尿病[11]、肥胖人群[12]的腸道菌群表現(xiàn)出了高擬桿菌門(mén)和低厚壁菌門(mén)的現(xiàn)象，擬桿菌門(mén)增加可能與肝臟炎癥存在一定的相關(guān)性，但目前尚無(wú)明確的結(jié)論，需進(jìn)一步研究。

一般來(lái)說(shuō)，人體的腸道粘膜可作為防御外源性物質(zhì)進(jìn)入血液的第一道天然屏障。外源性物質(zhì)在腸道中往往會(huì)受到腸道粘膜抗原和炎性因子的免疫監(jiān)視，一旦逃避其免疫監(jiān)視，肝臟則充當(dāng)了第二道屏障的作用。慢性肝病患者常有肝功能異常，導(dǎo)致肝細(xì)胞膽汁排泄功能減弱，使得腸道中微生態(tài)環(huán)境發(fā)生變化，肝臟解毒能力降低，造成腸道中有毒物質(zhì)的蓄積而破壞腸道粘膜屏障，這樣容易給過(guò)路菌提供接觸及吸附黏膜的機(jī)會(huì)，從而使得環(huán)境有害細(xì)菌過(guò)度的生長(zhǎng)，腸壁局部防御能力降低，而這些因素都可以使慢性肝病患者腸道菌群失調(diào)加重。本研究在屬的水平上研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者Lactococcus屬顯著減少。Lactococcus屬是人體腸道中的一種優(yōu)勢(shì)菌，也是益生菌，其數(shù)量的減少可能會(huì)削弱宿主部分的生理功能，對(duì)宿主的健康狀態(tài)造成不良影響，而其最明顯的表現(xiàn)就是讓一些外源性的有害菌及條件致病菌數(shù)量增加，對(duì)腸道的免疫屏障造成損害，最終引起細(xì)菌的移位，導(dǎo)致體內(nèi)多個(gè)臟器的嚴(yán)重細(xì)菌感染。Streptococcus屬?gòu)V泛存在于自然界及人和動(dòng)物糞便或鼻咽部，為條件致病菌。該屬細(xì)菌顯著增加的可能原因是由于慢性肝病破壞了腸道的免疫屏障，使得Streptococcus屬移位至腸道，導(dǎo)致腸道Streptococcus屬數(shù)量的上升，從而加劇了腸道菌群的失調(diào)。

有關(guān)腸道菌群紊亂導(dǎo)致NAFLD發(fā)病的可能機(jī)制涉及多方面。例如，革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 導(dǎo)致 Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）信號(hào)通路活化，后者可能與胰島素抵抗和NASH發(fā)病密切相關(guān)[13，14]。LPS還可導(dǎo)致組織膽堿含量減少，增加脂肪聚集肝臟[15]，促進(jìn)內(nèi)源性乙醇合成[16]和小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)等有關(guān)[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)益生菌 （例如 VSL#3、Lactobacillus bulgaricus、Streptococcus thermophilus、Bifidobacterium）或益生元干預(yù)后可以改善脂肪肝動(dòng)物模型肝臟脂肪含量和脂肪酸β氧化。對(duì)NAFLD患者進(jìn)行益生菌干預(yù)后也可以發(fā)現(xiàn)血清TNF-α、IF-6、ALT、AST和IL-10等水平降低[18]。因此，通過(guò)改變腸道微生態(tài)（如補(bǔ)充益生菌）來(lái)調(diào)節(jié)腸道能量的吸收或減少腸源性?xún)?nèi)毒素血癥（Intestinal endotoxaemia，IETM）的產(chǎn)生，是 NAFLD臨床治療的新“靶點(diǎn)”，對(duì)于NAFLD甚至代謝性疾病的治療可能是一個(gè)很有希望的突破。當(dāng)然，在臨床試驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)涉及到的腸道菌群重塑后的穩(wěn)定性、飲食對(duì)于腸道菌群的調(diào)控作用、抗生素對(duì)于腸道菌群的影響以及糞便移植的方法學(xué)等，都需要更多的研究來(lái)解決。

本研究還存在一些不足，如樣本量較少，尚未分析NASH或肝纖維化程度與腸道菌群失調(diào)的關(guān)聯(lián)。這些還有待于今后繼續(xù)擴(kuò)大樣本量后進(jìn)行相關(guān)研究，從而為豐富NAFLD的發(fā)病機(jī)制和危險(xiǎn)因素預(yù)警等機(jī)制研究提供重要的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

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