潘高峰，郜玉峰，葉嬌嬌，姜同翠，沈玉君，沈玉先

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染可引起多種慢性肝病。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）是一種細(xì)胞自我防御機(jī)制，適度的ERS有益于細(xì)胞的存活，但持續(xù)的ERS則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不可逆的損傷，甚至細(xì)胞凋亡。研究證實(shí)[1，2]，HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)復(fù)制可觸發(fā)ERS，或者說(shuō)ERS與慢性HBV感染后疾病進(jìn)展密切相關(guān)。各種病理因素觸發(fā)ERS后，激活肌醇酶（Inositol-requiring enzyme 1，IRE1）-X 盒結(jié)合蛋白 l（X-box binding protein-1，XBP1）軸、RNA依賴(lài)的蛋白激酶樣激酶-真核翻譯始動(dòng)因子 2-α（Protein kinase RNA-like ER kinase-eukaryotic initiation factor 2α，PERK-Eif2α） 軸和活化轉(zhuǎn)錄因子 6（Activating transcription factor 6，ATF6）軸三條信號(hào)通路，從而調(diào)控ERS相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose regulated protein 78，GRP78）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）和 XBP1基因均為 ERS相關(guān)基因，ERS發(fā)生時(shí)它們的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)增強(qiáng)。GRP78蛋白為熱休克蛋白70（Hsp70）家族的一員，在細(xì)胞保護(hù)、神經(jīng)變性疾病進(jìn)展和腫瘤的防治中起關(guān)鍵作用[3]。CHOP廣泛分布于組織細(xì)胞中，與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及能量代謝密切相關(guān)[4]。XBP1屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白，為未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded protein response，UPR）中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)蛋白的分泌、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)。研究認(rèn)為，XBP1與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和病毒感染等多種病理狀態(tài)有著密切的關(guān)系[5]。目前，有在轉(zhuǎn)染了HBV的肝細(xì)胞株細(xì)胞發(fā)生ERS的報(bào)道[6]，但對(duì)于慢性HBV感染者體內(nèi)是否存在ERS卻鮮有報(bào)道。為此，我們擬對(duì)無(wú)癥狀HBV攜帶者（Asymptomatic hepatitis B virus carriers，ASC）、慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）、乙型肝炎肝硬化（Liver cirrhosis，LC）和乙型肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）患者外周血白細(xì)胞GRP78、CHOP和XBP1 RNA水平進(jìn)行檢測(cè)，首次探討了ERS在慢性HBV感染性疾病進(jìn)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源 選取2012年9月2014年3月我科診治的ASC 43例，男30例，女13例；平均年齡（35.0±10.4）歲。CHB47例，男 39例，女8例；平均年齡（36.5±11.5）歲。LC 41例，男29例，女12例；平均年齡（52.3±10.6）歲；HCC 35例，男28例，女7例；平均年齡（51.5±10.7）歲。診斷參照2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[7]和有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。所有病例均無(wú)重疊其它肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷、酒精性肝病及其它疾病。同時(shí)選取40例體檢健康人（Normal healthy controls，NC）作為對(duì)照，男28例，女12例；平均年齡（31.0±12.0）歲。本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有研究者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 外周血白細(xì)胞GRP78、CHOP和XBP1 mRNA的檢測(cè) 采集空腹外周血1 ml，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后離心，棄上清液，留白細(xì)胞沉淀，加入TRIzol混勻，提取RNA（美國(guó)Invitrogen公司），在1%瓊脂糖電泳鑒定RNA。使用Quawell Q5000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA水平及純度。按照TaKaRa PrimScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總體積為10 μl，反應(yīng)條件為37℃ 15 min，85℃ 15 s。按照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的 GRP78、CHOP和 XBP1和GAPDH基因序列，用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)人源引物，委托上海生工公司合成，引物序列為：GAPDH 引物:上游 5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游 5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′；GRP78 引物: 上游 5′-GCACAGACGGGTCATTCCAC-3′，下游5′-CCTATGTCGCCTTCACTCC-3′；CHOP引物:上游 5′-CACTCTTGACCCTGCTTCTC-3′，下游 5′-TCTTCCTCCTCTTCCTCCTG-3′；XBP1引物:上游5′-ATGGATTCTGGCGGTATTG-3′，下游5′-GGGAAGGGCATTTGAAGA-3′。以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版，按照SYBR Green PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）說(shuō)明書(shū)采用實(shí)時(shí)定量PCR法（美國(guó)Thermo公司）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖電泳，鑒定目的基因片段，GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)水平[8]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。先對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（ln基因水平），結(jié)果以（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，三組和三組以上比較時(shí)，先采用單因素方差分析，再采用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同HBV感染者外周血白細(xì)胞GRP78、CHOP和 XBP1 mRNA水平變化 結(jié)果顯示，NC、ASC、CHB、LC和HCC五組之間GRP78 mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.593，P=0.00）；進(jìn)一步進(jìn)行兩兩組間分析顯示，ASC、CHB、LC和HCC組 GRP78 mRNA水平均高于NC組（P=0.01），其余任意兩組之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 1）；NC、ASC、CHB、LC和HCC五組之間CHOP mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步進(jìn)行任意兩組之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義 ；NC、ASC、CHB、LC和 HCC五 組 之 間 XBP1 mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.666，P=0.00）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩組間分析顯示，ASC、CHB、LC和HCC組XBP1 mRNA水平均高于NC組（P＜0.05），其余任意兩組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖1 慢性HBV感染者外周血白細(xì)胞GRP78 mRNA水平比較 ASC、CHB、LC和HCC組 GRP78 mRNA水平均高于NC組（P≤0.01），其余任意兩組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖2 慢性HBV感染者外周血白細(xì)胞XBP1mRNA水平比較ASC、CHB、LC和HCC組 XBP1mRNA水平均高于NC組（P＜0.05），其余任意兩組之間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2 外周血白細(xì)胞GRP78、CHOP和XBP1 mRNA水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 根據(jù)HBsAg水平、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）水平、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）水平、乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis B virus e antige n，HBeAg） 定性、HBV DNA 以及總膽紅素（Total bilirubin，TBIL）水平，將146例HBV感染者進(jìn)行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRP78 mRNA在不同水平HBsAg分組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.552，P=0.012）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)，HBsAg＜1500IU/ml組與＞20000IU/ml組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）；HBV DNA 定量=（103～105） copies/ml組 XBP1 mRNA水平低于＞105copies/ml組（t=-2.127，P=0.036）；CHOP mRNA水平在不同臨床指標(biāo)分組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GRP78 mRNA 水平在不同 ALT、AST、TBIL、HBV DNA和HBeAg定性分組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；XBP1 mRNA 水平在不同 ALT、AST、TBIL、HBsAg 和HBeAg定性分組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1～表3）。

表1 不同臨床指標(biāo)HBV感染者外周血GRP78 mRNA水平（）比較

表1 不同臨床指標(biāo)HBV感染者外周血GRP78 mRNA水平（）比較

指標(biāo) 分組 GRP78 mRNA P值HBsAg（IU/ml） <1500 0.48±0.59 0.012 1500～20000 0.76±0.56>20000 0.74±0.56 HBeAg 陽(yáng)性 0.70±0.58 0.075陰性 0.53±0.59 ALT（IU/ml） <80 0.01±0.61 0.607 80～250 0.67±0.72>250 0.70±0.41 AST（IU/ml） <80 0.64±0.60 0.579 80～250 0.58±0.69>250 0.50±0.50 HBVDNA（lg copies/ml） <1×3 0.54±0.60 0.398 1×3～5 0.70±0.57＞1×5 0.65±0.61 TBIL（μmol/l） <17.1 0.69±0.53 0.11 17.1 0.54±0.67

表2 不同臨床指標(biāo)HBV感染者外周血CHOP mRNA水平（）比較

表2 不同臨床指標(biāo)HBV感染者外周血CHOP mRNA水平（）比較

指標(biāo) 分組 CHOP mRNA P值HBsAg（IU/ml） <1500 0.44±0.45 0.122 1500～20000 1.23±3.10>20000 0.72±0.78 HBeAg 陽(yáng)性 0.91±2.66 0.466陰性 0.64±1.48 ALT（IU/ml） <80 0.97±2.40 0.26 80～250 0.63±1.42>250 0.22±1.50 AST（IU/ml） <80 0.94±2.39 0.305 80～250 0.54±1.28>250 0.22±1.70 HBVDNA（lg copies/ml） <1×3 0.93±3.13 0.685 1×3～5 0.86±1.49>1×5 0.59±1.41 TBIL（μmol/l） <17.1 0.86±1.22 0.67 17.1 0.71±2.89

表3 不同臨床指標(biāo)HBV感染者外周血XBP1mRNA水平（）比較

表3 不同臨床指標(biāo)HBV感染者外周血XBP1mRNA水平（）比較

分組 XBP1mRNA水平 P值HBsAg（IU/ml） <1500 1.04±1.58 0.243 1500～20000 1.22±1.10>20000 1.55±0.68 HBeAg 陽(yáng)性 1.16±1.10 0.741陰性 1.23±1.54 ALT（IU/ml） <80 1.14±1.37 0.836 80～250 1.31±1.25>250 1.21±0.94 AST（IU/ml） <80 1.25±1.38 0.484 80～250 0.98±0.80>250 0.95±1.25 HBVDNA（lg copies/ml） <1×3 1.11±1.34 1Χ3～5 0.86±1.13 0.04>1×5 1.44±1.31 TBIL（μmol/l） <17.1 1.38±1.15 0.051 17.1 0.97±1.42指標(biāo)

3 討論

GRP78、CHOP和XBP1基因是從30000個(gè)基因中篩選出來(lái)的ERS相關(guān)基因，ERS能上調(diào)它們的表達(dá)。病毒感染、缺氧、鈣離子超載等各種病理因素均可觸發(fā) UPR，啟動(dòng) IRE1-XBP1、PERK-eIF2a和 ATF6三條通路，促使GRP78、CHOP和XBP1基因表達(dá)上調(diào)。適度的ERS為細(xì)胞的一種自我保護(hù)反應(yīng)，過(guò)度的ERS則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。CHOP作為促凋亡因子，參與了ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。GRP78和XBP1在多種疾病中可以保護(hù)相關(guān)細(xì)胞免受損傷，推測(cè)它們?cè)贖BV感染后疾病進(jìn)程中可能保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷。大量研究證實(shí)，HBV本身、HBV相關(guān)蛋白及病程中產(chǎn)生的炎癥和氧化應(yīng)激均可觸發(fā) ERS[2，6，9，10]。ERS與 HBV感染后肝臟非可控性炎癥的發(fā)生發(fā)展與惡性轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，但確切的調(diào)控機(jī)制尚未明確。進(jìn)一步研究ERS與HBV慢性感染后肝臟疾病進(jìn)展的關(guān)系對(duì)于肝臟疾病的防治具有重要的臨床意義。因此，我們檢測(cè)了慢性HBV感染者外周血ERS標(biāo)志基因GRP78、CHOP和XBP1 mRNA水平，結(jié)果表明：與NC組相比，GRP78 mRNA和XBP1 mRNA在慢性HBV感染后疾病進(jìn)展的各個(gè)階段均呈高水平。GRP78和CHOP的顯著上調(diào)是發(fā)生ERS的主要特征，提示HBV感染后各階段存在ERS，證實(shí)了ERS參與CHB發(fā)病過(guò)程。

肝硬化是肝纖維化的后期表現(xiàn)，慢性HBV感染可引起肝纖維化。目前認(rèn)為，ERS誘導(dǎo)的凋亡、炎癥和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作為一種刺激因素參與了組織損傷和纖維化的發(fā)生發(fā)展[11，12]。細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）是產(chǎn)生肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。TGF-β1作為人體內(nèi)TGF-β的主要亞型，一方面能促進(jìn)ECM的形成，另一方面可通過(guò)多種途徑抑制ECM的降解，從而參與肝纖維化的形成和發(fā)展[13]。UPR誘導(dǎo)的凋亡可以導(dǎo)致TGF-β的釋放，進(jìn)一步刺激纖維化的發(fā)生發(fā)展[14]，推測(cè)ERS參與肝硬化的形成，LC患者XBP1和GRP78 mRNA水平上調(diào)支持這種推斷。ERS可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、DNA損傷和COX-2表達(dá)，激活A(yù)kt/mTOR信號(hào)通路，激活ERS相關(guān)基因ATF6、XBP1和CHOP的表達(dá)，抑制ERS相關(guān)凋亡途徑等參與HBV相關(guān)性肝癌的形成[15]。此外，ERS可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間的轉(zhuǎn)化，而后者與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。臨床研究證實(shí) ，肝癌患者體內(nèi)GRP78自身抗體水平顯著高于慢性乙型肝炎患者和肝炎肝硬化患者[17]。另外，已有研究證實(shí)，與正常肝臟及肝硬化組織比較，肝癌組織中GRP78蛋白高表達(dá)[18]，與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌組外周血白細(xì)胞GRP78 mRNA高水平結(jié)果相符。此外，GRP78的高表達(dá)還可以對(duì)抗細(xì)胞凋亡及化療藥物對(duì)癌細(xì)胞的損傷，并促進(jìn)腫瘤血管的生成[19]，因此其高表達(dá)有助于肝癌的發(fā)生發(fā)展及耐藥，我們的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GRP78與肝癌形成的關(guān)系。研究證實(shí)，肝細(xì)胞癌中剪切型XBP1 mRNA水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)[20]。本實(shí)驗(yàn)肝癌組XBP1 mRNA高水平，亦提示XBP1可能參與肝癌的形成，但有待進(jìn)一步研究其剪切型 mRNA的表達(dá)情況。

按HBsAg水平分組，三組間GRP78 mRNA水平存在差異（F=4.552，P=0.01），進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)>20000 IU/ml組要高于<1500 IU/ml組（P=0.01）。HBsAg水平越高，所導(dǎo)致的ERS越強(qiáng)烈，GRP78的表達(dá)量就越高，但XBP1和CHOP在不同HBsAg水平分組上未見(jiàn)差異，尚有待于后續(xù)擴(kuò)大樣本明確。XBP1 mRNA水平在低水平病毒載量組要低于高病毒載量組（t=-2.127，P=0.036），可能是因?yàn)楦咻d量的HBV會(huì)導(dǎo)致更強(qiáng)烈的ERS，從而導(dǎo)致XBP1的高水平。一般而言，HBeAg陽(yáng)性、膽紅素持續(xù)升高和轉(zhuǎn)氨酶升高往往提示肝臟損傷持續(xù)加重，可能發(fā)生嚴(yán)重的ERS，最終導(dǎo)致ERS相關(guān)基因的高表達(dá)。

HBV感染后的多種因素可以觸發(fā)ERS。本研究首次證實(shí)慢性HBV感染者體內(nèi)存在ERS，并證實(shí)ERS參與慢性HBV感染后的疾病進(jìn)展，但確切的調(diào)控機(jī)制仍不明確。深入研究ERS在慢性HBV感染后疾病進(jìn)展中的作用機(jī)制有著非常重要的臨床意義，藉此可以篩選及鑒定肝臟炎癥、纖維化及惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及靶點(diǎn)。

[1]Dara L，JC，Kaplowitz N.The contribution of endoplasmic reticulum stress to liver diseases.Hepatology，2011，53（5）:1752-1763.

[2]Montalbano R，Di Fazio P，Quint K，et al.Induction of endoplasmic reticulum-mediated stress pathways in liver cancer cell lines after overexpression of hepatitis b virus envelope proteins.Z Gastroenterol，2012，50（1）:539.

[3]He B.Viruses，endoplasmic reticulum stress，and interferon responses.Cell Death Differ,2006,13（3）:393-403.

[4]Pereira RC，Stadmeyer LE，Smith DL，et al.CCAT/enhancerbinding protein homologous protein（chop）decreases bone formation and causes osteopenia.Bone，2007，40（3）:619-626.

[5]張霞麗，萬(wàn)福生.X-盒結(jié)合蛋白 1的生理及病理生理學(xué)作用.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31（11）：1289-1292.

[6]Wang LH，Huang W，Lai MD，et al.Aberrant cyclin a expression and centrosome overduplication induced by hepatitis b virus pre-s2 mutants and its implication in hepatocarcinogenesis.Carcinogenesis，2011，33（2）:466-472.

[7]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.實(shí)用肝臟病雜志，2011，14（2）：81-89.

[8]陳瑩，李成錦，楊文，等.MANF對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（11）:1308-1312.

[9]Zhang K.Integration of er stress，oxidative stress and the inflammatory response in health and disease.Int J Clin Exp Med，2010，3（1）:33.

[10]Cho HK，Cheong KJ，Kim HY，et al.Endoplasmic reticulum stress induced by hepatitis b virus x protein enhances cyclooxygenase 2 expression via activating transcription factor 4.Biochem J，2011，435（2）:431-439.

[11]Tanjore H，Lawson WE，Blackwell TS.Endoplasmic reticulum stress as a pro-fibrotic stimulus.Biochim Biophys Acta，2013，1832（7）:940-947.

[12]Lenna S，Trojanowska M.The role of endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response in fibrosis.Curr Opin Rheumatol，2012，24（6），663-668.

[13]徐超，馬勇.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝病發(fā)病中的作用研究進(jìn)展.實(shí)用肝臟病雜志，2012，17（2）:206-209.

[14]Minicis S，Candelaresi C，Agostinelli L，et al.Endoplasmic reticulum stress induces hepatic stellate cell apoptosis and contributes to fibrosis resolution.Liver Int，2012，32（10）:1574-1584.

[15]潘高峰，李旭，郜玉峰.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在慢性HBV感染發(fā)病中的作用. 中華臨床感染病雜志，2013，6（5）：316-319.

[16]吳冬，柯愛(ài)武，郭傳勇.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在肝纖維化和肝細(xì)胞癌發(fā)病中的作用研究進(jìn)展.實(shí)用肝臟病雜志，2011，14（6）：475-477.

[17]Shao Q，Ren P，Li Y，et al.Autoantibodies against glucoseregulated protein 78 as serological diagnostic biomarkers in hepatocellular carcinoma.Int J Oncol，2012，41（3）:1061-1067.

[18]周程敏，董浦江，付小利.Grp78蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（7）：809-810.

[19]Li J，Lee AS.Stress induction of grp78 and its role in cancer.Curr Mol Med，2006，6（1）:45-54.

[20]Shuda M，Kondoh N，Imazeki N，et al. Activation of the atf6，xbp1 and grp78 genes in human hepatocellular carcinoma:A possible involvement of the er stress pathway in hepatocarcinogenesis.J Hepatol，2003，38（5）:605-614.