于新友+李天芝+沈志強(qiáng)

摘要：根據(jù)GenBank公布的小鵝瘟病毒VP1基因保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，建立了檢測小鵝瘟病毒PCR方法，并對(duì)其特異性、敏感性進(jìn)行了研究。該P(yáng)CR方法對(duì)小鵝瘟病毒擴(kuò)增結(jié)果為陽性，對(duì)照毒株擴(kuò)增結(jié)果均為陰性;對(duì)小鵝瘟病毒檢測的靈敏性為1pg總DNA量。以上結(jié)果表明，該P(yáng)CR方法特異性強(qiáng)、敏感性高、簡便、快速，可用于小鵝瘟的早期確診和病毒鑒定。

關(guān)鍵詞：小鵝瘟病毒;PCR;檢測

中圖分類號(hào)：Q789 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B ? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2015）03-0031-04

小鵝瘟（Gosling plague，GP）是由小鵝瘟病毒（Gosling plague virus，GPV）所引起的雛鵝的一種急性或亞急性敗血性傳染病。病鵝臨床表現(xiàn)為下痢、腿癱瘓、精神萎靡、食欲廢絕，主要病理學(xué)特征為小腸中后段黏膜壞死、脫落，有纖維素性滲出物凝固形成臘腸狀栓子[1]。該病主要危害3～20日齡小鵝，特別是10日齡之內(nèi)的雛鵝更易感染，發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%，且傳播速度快，是對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重危害的一種重要傳染病[2]。1956年我國科研工作者首先報(bào)道了小鵝瘟這種疾病[3]，此后世界上許多國家都有該病的報(bào)道。目前，GPV診斷方法有病毒的分離和鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[4]、反向間接血凝試驗(yàn)[5]、免疫酶瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)[6]和PCR方法[7]等，但是上述方法均存在不同的缺點(diǎn)，或檢測靈敏度低，或檢測時(shí)間長，或操作復(fù)雜。近年來，發(fā)展PCR檢測方法具有檢測速度快、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的檢測。筆者通過不斷優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了檢測小鵝瘟病毒PCR方法，為小鵝瘟的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種簡便、快速、有效的方法。

1 ?材料和方法

1.1 ?病毒株與病料 ?小鵝瘟病毒、鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝H9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒由本實(shí)驗(yàn)室保存，臨床檢測病料為2014年采自山東省各地小鵝場臨床診斷為GPV感染的小鵝的肝臟、脾臟等。

1.2 ?工具酶及試劑盒 ?pMD18-T載體、Premix Tag、DL2000 MarKer購自大連寶生物公司，AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司，DNA凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 ?PCR引物設(shè)計(jì)與合成 ?根據(jù)GenBank中登錄的GPV基因序列（AY382889），應(yīng)用Primer Premier5.0軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增GPV的VP1基因507bp部分片段。引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′-ATGTGAGAAAGCAAACTT-3′，下游引物：5′-CTATCTATAAAGTCCTGG-3′。

1.4 ?GPV基因組DNA的提取 ?按AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒使用說明書提取GPV的DNA，并提取其它幾種病毒的核酸。

1.5 ?GPV VP1基因的PCR反應(yīng)條件的確立 ?以提取的GPV DNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增VP1基因。在其它條件不變的情況下，對(duì)反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，分別采用42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃等6種不同的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增;在其它條件不變的情況下，對(duì)反應(yīng)的引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，分別采用0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L等6種不同引物濃度進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系保持為25μl，PCR反應(yīng)的條件保持不變，為95℃預(yù)變性5min，95℃ 30S、46℃ 30S，72℃ 30S ，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.6 ?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定 ?取5μl PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果。如果有目的條帶，則切下目的條帶，按照DNA凝膠回收試劑盒的說明書操作，回收目的片段VP1。將回收后的VP1與pMD18-T連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落搖菌過夜，按質(zhì)粒提取試劑盒的說明書抽提培養(yǎng)菌液的質(zhì)粒，用建立的PCR方法檢測質(zhì)粒是否含有VP1基因。如果含有VP1基因，將提取的質(zhì)粒發(fā)送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與參照的GPV基因序列進(jìn)行基因相似性分析。

1.7 ?特異性試驗(yàn) ?分別提取小鵝瘟病毒、鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝H9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒等7種不同的病毒核酸作為模板，用已建立的PCR檢測方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.8 ?敏感性試驗(yàn) ?提取GPV基因組DNA，用儀器測定含量，然后10倍系列稀釋，使GPV基因組DNA的含量分別為10ng DNA、1ng DNA、100pg DNA、10pg DNA、1pg DNA、0.1pg DNA。分別將其作為模板，用建立的方法分別進(jìn)行PCR檢測擴(kuò)增，確定PCR檢測方法的敏感性。

1.9 ?重復(fù)性試驗(yàn) ?為了驗(yàn)證所建立PCR檢測方法的重復(fù)性，分別提取3批小鵝瘟陽性病料、陰性病料以及6種陰性對(duì)照病毒如鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝H9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒的核酸作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.10 ?臨床樣品的檢測 ?提取臨床上送檢的25份GP疑似病料的基因組DNA作為模板，用建立的PCR檢測方法擴(kuò)增檢測，并用生物學(xué)軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。endprint

2 ?結(jié)果

2.1 ?擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 ?用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果在507bp出現(xiàn)目的DNA條帶，見圖1，和預(yù)期大小一致（預(yù)期大小為507bp）。

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2.2 ?特異性試驗(yàn) ?利用所設(shè)計(jì)的引物及所確定的最佳反應(yīng)條件分別對(duì)小鵝瘟病毒、鵝副粘病毒、鵝病毒性肝炎病毒、鵝源鴨瘟病毒、鵝圓環(huán)病毒、鵝H9亞型禽流感病毒和鵝呼腸孤病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果7個(gè)毒株中只有小鵝瘟病毒能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，大小為507bp（預(yù)期507bp），而其它均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，見圖2。說明本研究建立的方法特異性好。

2.3 ?敏感性試驗(yàn) ?用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5份樣品產(chǎn)物在507bp位置均有目的條帶，與預(yù)期一致;1份樣品產(chǎn)物無擴(kuò)增條帶。結(jié)果顯示，引物的檢測靈敏度可達(dá)1pg DNA，見圖3。

2.4 ?重復(fù)性試驗(yàn) ?重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，3批不同的病料的檢測結(jié)果相同，說明建立的PCR檢測方法重復(fù)性好、可靠、穩(wěn)定。

2.5 ?擴(kuò)增產(chǎn)物測序 ?測序結(jié)果如下： ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ATGTGAGAAAGCAAACTTTCCTGAATTTCAACCTCTGGGAGAAAATTATTGTGATGAACATGGGTGGTATGATTGTGCTATATGTAAAGAGTTGAAAAATGAACTTGCAGAAATTGAGCATGTGTTTGAACTTGATGATGCTGAAAATGAACAATAAAGATGACTCAAAGCAGATATGTCTACTTTTTTAGATTCTTTTGAAGAGTGGTATGAAACTGCAGCCGCCTCGTGGCGGAATCTGAAAGCTGGAGCCCCTCACCCAAAACCAAACCAGCAGACTCAGTCTGTGTCTCCAGCCAGAGAACCCGAACGAAGAGATAATAACCGGGGCTTTGTACTTCCTGGCTATAAGTATCTTGGCCCTGGTAACGGCCTTGATAAAGGGCCACCCGTTAATAAGGCGGACAGCGTCGCGCTTGAACACGACAAGGCCTACGACCAACAGCTTAAAGCGGGAGACAACCCATATATAAAATTCAATCACGCTGACCAGGACTTTATAGATA

將測序結(jié)果與參照的GPV基因序列進(jìn)行基因相似性分析，其同源性為100%。

2.6 ?臨床樣品的檢測 ?用建立的方法檢測的25份GP病料中，有7份結(jié)果呈陽性。

3 ?討論

邵洪澤等[8]根據(jù)小鵝瘟病毒VP3基因設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，建立了用于檢測小鵝瘟病毒的PCR方法。該法每 5μl樣品中獲得陽性擴(kuò)增結(jié)果中最小檢出量為2.5×10-1.58ELD50小鵝瘟病毒量。本試驗(yàn)對(duì)GenBank公布的GPV基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GPV VP1基因相對(duì)比較保守，查找出其高度保守區(qū)域，參照GenBank中登錄的GPV基因序列（AY382889），利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增出目的基因，連接到pMD18-T載體，送樣測序，對(duì)測序結(jié)果與模板序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性為100%。對(duì)退火溫度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)退火溫度值為46℃時(shí)，才能獲得較為理想的產(chǎn)物，即使相差2℃也不能獲得理想的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，在引物濃度為0.2～1.2μmol/L時(shí)不影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率相對(duì)較高的引物濃度為0.6μmol/L，增效率相對(duì)較低的引物濃度為1.2μmol/L。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，引物的檢測靈敏度可以達(dá)到1pg DNA。本試驗(yàn)所建立的GPV PCR檢測方法能夠擴(kuò)增出507bp目的片段，而對(duì)常見的小鵝病病毒：如小鵝細(xì)小病毒、小鵝圓環(huán)病毒、鵝源鴨瘟病毒、小鵝肝炎病毒、小鵝H9亞型禽流感病毒和小鵝副粘病毒均無擴(kuò)增產(chǎn)物，證明本方法具有很好的特異性。用建立的GPV PCR檢測方法，檢測20份小鵝瘟病料，檢出7份陽性病料，因此，本試驗(yàn)所建立的方法為GP的流行病學(xué)調(diào)查和檢測提供了一種簡單、快速和有效的方法。

參考文獻(xiàn)：

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[8] ?邵洪澤，李琳，毛文智，等.鵝細(xì)小病毒PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2009，5（30）5-9.endprint